Совершенствование лечебно-диагностических подходов при цервикальном предраке, ассоциированном с папилломавирусной инфекцией (17.09.2012)

Автор: Самосудова Ирина Болеславовна

Практическая значимость. Определено клиническое значение иммуноцитохимического маркера р16 и Е7 в цервикальных пробах больных с CIN посредством неинвазивной методики забора материала. Разработаны дополнительные критерии рациональной тактики ведения пациенток с ВПЧ–ассоциированными CIN. Предложен алгоритм ведения больных с цервикальным предраком в зависимости от тяжести процесса и пациенток с латентной папилломавирусной инфекцией. Установлено повышение клинико–микробиологической эффективности лечения больных с ВПЧ–ассоциированными CIN при использовании комбинированного метода (хирургический в сочетании с инозин пранобексом) в сравнении с традиционным лечением.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. ВПЧ–ассоциированные эпителиальные поражения шейки матки высокой степени (CINII-III) характеризуются преобладанием ВПЧ 16 типа в варианте моноинфекции и сочетанной инфекции, повышением вирусной нагрузки на фоне преимущественно персистирующего течения папилломавирусной инфекции в сравнении с поражениями низкой степени (CINI).

2. При CINII-III на фоне ВПЧ в отличие от здоровых и инфицированных пациенток с CINI определяется повышение частоты экспрессии р16 в сочетании с гипер -, коэкспрессией с Ki-67 в цервикальном эпителии, что коррелирует с экспрессией онкобелка Е7 и значением клинико–кольпоскопического индекса.

3. Комплексное лечение пациенток с ВПЧ-ассоциированными CINII-III предусматривает комбинацию хирургического и противовирусного компонентов, что способствует повышению клинической эффективности (80%), элиминации ВПЧ (86,7%) на фоне снижения экспрессии р16, Ki-67, Е7.

Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты исследования внедрены в работу специализированного приема по патологии шейки матки БУЗОО «Женская консультация №1» г. Омска.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международной научно-практической конференции «Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее» (Москва, 2008), III региональном научном форуме «Мать и дитя» (Саратов, 2009), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011), областной конференции «Современные подходы к комплексной диагностике и лечению патологии шейки матки» (Омск, 2011), XII, XIII Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2011, 2012), Всероссийском конгрессе с международным участием «Амбулаторно–поликлиническая практика – в эпицентре женского здоровья» (Москва, 2012), расширенном межкафедральном заседании кафедр акушерства и гинекологии ОмГМА (Омск, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, пять из которых в научных изданиях, рекомендованных ВАК. Получено решение о выдаче патента на изобретение (регистрационный № 2011129529/14; заявл. 15.07. 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Работа изложена на 177 страницах машинописного текста, иллюстрирована 48 таблицами, 36 рисунками. Библиографический указатель содержит 116 отечественных и 103 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы. Работа выполнена на базе БУЗОО «Женская консультация №1» г. Омска (главный врач – Л.И. Цыганкова, с 2011г. - Л.М. Ивлева), Академического центра лабораторной диагностики ОмГМА (зав. - д.м.н., профессор Т.И. Долгих), БУЗОО Клинический диагностический центр (главный врач – В.Г. Колоколов), БУЗОО «КОД» (главный врач – С.Н. Орлов) с 2010 по 2012гг. Методом целенаправленного отбора проведено обследование 230 пациенток в возрастном интервале от 18 до 45 лет в дизайне открытого когортного проспективного контролируемого исследования (рис.1). В результате ВПЧ-тестирования были определены 3 группы больных: с ВПЧ-ассоциированными CIN (n=100), неинфицированные больные с CIN (n=50) и группа пациенток с латентной формой ПВИ (n=50). На основании морфологического исследования больные с ВПЧ-ассоциированными CIN были дифференцированы на две основные группы: 1-я основная группа включала больных с CINI (n=50), 2-я основная группа - больных c CINII-III (n=50). Неинфицированные больные с CIN составили две группы сравнения: 1-я группа сравнения – больные с CINI (n=30), 2-я группа сравнения – больные с CINII-III (n=20). Пациентки с латентной формой ПВИ (n=50) составили 3-ю группу сравнения. Группа контроля включала 30 здоровых женщин репродуктивного возраста (n=30). В зависимости от метода лечения больных с CIN, каждая из основных групп методом адаптивной рандомизации была разделена на 2 подгруппы: IА группа (n=20) - консервативное ведение с использованием препарата инозин пранобекс (ИП), IБ группа (n=30) - сочетанный метод лечения (хирургический в сочетании с ИП); IIА группа (n=20) - хирургический метод лечения, IIБ (n=30) - комбинированный метод лечения (хирургический в сочетании с ИП). Критериями включения в основные группы явилось: наличие позитивного ВПЧ–теста, наличие SIL по данным цитологического исследования, гистологически верифицированный диагноз CINI, CINII, CINIII. Критерии включения в 1 и 2 группы сравнения: наличие негативного ВПЧ–теста, наличие SIL по данным цитологического исследования, гистологически верифицированный диагноз CINI, CINII, CINIII. Критерии включения в 3 группу сравнения: наличие позитивного ВПЧ–теста, отсутствие SIL и CIN по данным морфологического исследования. Критерии включения в группу контроля: наличие негативного ВПЧ–теста, отсутствие SIL и CIN по данным морфологического исследования. Репродуктивный возраст и информированное согласие пациенток на обследование и лечение явились общими критериями включения для всех групп исследования. Критерии исключения из исследования: возраст моложе 18 и старше 45 лет, беременность, лактация, наличие острых воспалительных заболеваний и обострения хронических заболеваний в течение последних 6 месяцев, преинвазивный и инвазивный рак шейки матки, отказ пациентки от участия в предлагаемом исследовании. Методы исследования. Комплексное обследование пациенток, наряду с общеклиническим, включало традиционные методы поэтапной диагностики патологии шейки матки: кольпоскопия, морфологический метод исследования мазков, биоптатов шейки матки и соскобов эндоцервикса и адъювантные методы: типирование ВПЧ, определение вирусной нагрузки ВПЧ, иммуноцитохимическое определение р16, Ki-67 и выявление онкобелка Е7.

Рис. 1. Дизайн исследования

Цитологическое исследование проводилось традиционным методом и методом жидкостной цитологии, который использовали при сомнительных результатах традиционного цитологического исследования, наличии аномальных цитологических изменений у больных с нормальной кольпоскопической картиной и для иммуноцитохимического исследования. Цервикальный образец получали при помощи комбинации цервикальных щеток cytobrush и cervеx-brush. Для традиционного цитологического исследования материал наносили на обезжиренные предметные стекла с последующей фиксацией. Для исследования методом жидкостной цитологии клеточный материал шейки матки при помощи цервикальной щетки, собирали в виалы с транспортной средой и после центрифугирования и получения тонкослойного образца исследовали в лаборатории. Окраска стекол проводилась по Папаниколау с последующей интерпретацией цитологических образцов по терминологической системе Бетесда (2001г.). Кольпоскопическое исследование проводилось всем пациенткам с использованием кольпоскопа «SOM 52» Karl Kaps GmbH & Co.KG (Германия) и кольпоскопа серии КС- 01 с фотоприставкой (Санкт - Петербург). Для оценки состояния эпителия шейки матки применялся метод расширенной кольпоскопии с использованием уксусной пробы и пробы Шиллера с интепретацией кольпоскопических признаков в соответствии с Международной кольпоскопической классификацией (Барселона, 2003г.). Для унификации кольпоскопических результатов использовали кольпоскопический индекс R. Reid (2003) и клинико–кольпоскопический индекс M.Shafi and S. Nazeer (2006) с определением балльной оценки. Гистологическое исследование биоптатов шейки матки и эндоцервикальных образцов (после прицельного забора материала) проводилось в патоморфологической лаборатории БУЗОО «КОД» (главный врач – С.Н. Орлов). Гистологический материал биоптатов шейки матки фиксировался в 10% растворе формалина (на фосфатном буфере при рН 7,2 - 7,4) и подвергался обработке в гистологическом аппарате карусельного типа STP-120 (Microm, Германия). Серийные срезы толщиной 4 мкм из парафиновых блоков, окрашивались гематоксилином и эозином с последующим микроскопированием полученного образца. Пациенткам всех исследуемых групп проводилась оценка инфекционного статуса шейки матки при помощи молекулярно-биологических методов исследования в Академическом центре лабораторной диагностики (зав. центром - д.м.н., профессор Т.И. Долгих). Детекция Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, вируса простого герпеса (HSV), Ureaplasma species проводилась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) (АмплиСенс FL, «ИнтерЛабСервис», Москва). Детекция ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45 , 51, 52, 58, 59) и низкого риска (6, 11) выполнялась методом ПЦР (АплиСенс ВПЧ ВКР скрин-FL, АплиСенс 6/11–Eph, «ИнтерЛабСервис», Москва). Количественная оценка ВПЧ 16 и 18 типов определялась методом ПЦР в режиме реального времени с использованием тест–системы «АмплиСенс R–V12 (RG, iQ, Mx) скрин-титр FRT» (г. Москва). В зависимости от уровня выделяли низкую, среднюю и высокую вирусную нагрузку. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) для определения онкобелка Е7.Забор материала осуществляли из цервикального канала с помощью цервикальной щетки, помещали в эпендорф с 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида, замораживали при температуре не более 20° С. Проба проводилась из надосадочной жидкости после размораживания и центрифугирования образца с использованием тест–системы «Е7–ВПЧ–16/18–Диагност» (г. Москва). Иммуноцитохимический метод определения биомаркера р16ink4? и маркера пролиферации Ki-67 в цервикальных образцах (тест–система «CINtec® PLUS Kit», Германия) с оценкой особенностей их экспрессии при ПВИ выполняли на базе БУЗОО «КДЦ» (к.м.н. О.Н. Миронова). Статистический анализ данных проводился с применением пакета STATISTICA-6, пакета EpiInfo (версия 3.3), возможностей MS Excel. Во всех процедурах статистического анализа критический уровень значимости р принимался равным 0,05. Данные в тексте представлены в виде M±m, где M – среднее выборочное, m– стандартная ошибка среднего [Лапач С.Н. и соавт., 2000]. При распределении значений, отличном от нормального, в ряду указывалась медиана (P0,5), 25-процентиль (P0,25) и 75-процентиль (P0,75) [Гланц С., 1998]. Минимальный размер выборки был рассчитан с помощью номограммы Альтмана [Петри А., 2003]. Для сравнения качественных показателей в группах использовалась 2I-статистика (информационная статистика Кульбака) [Закс Л., 1976], точный критерий Фишера, метод углового преобразования Фишера. При сравнении количественных данных в двух независимых выборках использовался U-критерий Манна-Уитни, в двух связанных выборках - критерий Мак–Нимара [Реброва О.Ю., 2002]. В исследовании применялись методы анализа таблиц сопряженности, корреляционный анализ, расчет диагностической чувствительности и специфичности методов исследования [Власов В., 2006] (консультант - д.м.н., Д.В. Турчанинов).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На I этапе обследования 230 пациенток (средний возраст - 26,4±6,13 лет) на основании оценки анамнестических данных определены клинические различия в зависимости от тяжести цервикального предрака. Больные 2-й основной группы отличались более старшим возрастом в сравнении с больными 1-й группы и пациентками с латентной формой ПВИ (рис. 2). Двукратное преобладание частоты курения (62%), более редкое использование барьерной контрацепции и доминирование цервикальной патологии с деструктивным лечением шейки матки в анамнезе было характерно для пациенток 2-й основной группы в отличие от больных 1-й группы (р<0,05). У инфицированных больных основных групп, в сравнении с неинфицированными женщинами с CIN, статистически значимых различий по изучаемым критериям не установлено, включая особенности полового поведения, за исключением более юного возраста больных с CINI на фоне ВПЧ.

Рис.2. Средний возраст пациенток исследуемых групп (лет)

Примечание: код группы 1-1-я основная группа, 2-2-я основная группа, 3–1-я группа сравнения, 4–2-я группа сравнения, 5–3-я группа сравнения, 6– группа контроля

У больных с цервикальным предраком, независимо от степени поражения и наличия ВПЧ, установлен более ранний возраст полового дебюта, большее число половых партнеров в отличие от женщин группы контроля (р<0,05), что подтверждает роль поведенческих факторов риска в генезе CIN. Результаты оценки инфекционного статуса шейки матки. Проводилось генотипирование ВПЧ как у больных с CIN, так и пациенток с латентной формой ПВИ. У всех пациенток выявлены ВПЧ высокого канцерогенного риска с преобладанием 16 и 18 типов ВПЧ относительно других типов (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59). Сравнительный анализ позволил установить преобладание 16 типа ВПЧ у больных 2-й группы относительно пациенток 1-й группы (78,0±5,86% против 48,0±7,07% случаев) (р=0,002) и относительно женщин с латентной формой ВПЧ-инфекции (46,0±7,05%) (р=0,0009) (рис. 3). Другие типы ВПЧ ВКР доминировали в 1-й группе (41,0%) в отличие от 2-й (10,0%). Среди других типов ВПЧ в 1-й группе чаще были определены 31, 45 и 52 типы в отличие от 2-й группы (р(0,05). Обращало внимание отсутствие существенных различий по результатам типирования ВПЧ у больных с CINI и латентной формой инфекции (р>0,05). Доминирующий 16 тип ВПЧ во всех исследуемых группах был выявлен как в форме моноинфекции, так и в сочетании с другими типами ВПЧ ВКР. Обращало внимание, что во 2-й основной группе 16 тип ВПЧ в форме моноинфекции преобладал (50% случаев) относительно пациенток 1-й группы (24% случаев) (р=0,0062) и группы сравнения (16% случаев) (р=0,0003). Качественную составляющую ВПЧ–тестирования дополняли оценкой вирусной нагрузки 16, 18 типов ВПЧ. Установлено доминирование высокой вирусной нагрузки во 2-й основной группе по 16 типу ВПЧ (84,6%) и по суммарной вирусной нагрузке 16 и 18 типов (83,0%) в сравнении с 1-й группой

Рис.3. Наиболее распространенные типы ВПЧ у больных с СIN Примечание: * - р?0,05 при сравнении 1-й и 2-й основных групп, ** - р?0,05 - при сравнении 2-й основной и группы сравнения.

(р=0,001) (29,2 и 32,4%) и с группой пациенток с латентной формой ПВИ (р=0,001) (21,7 и 23,5% соответственно). Для пациенток 1-й основной группы и с латентной ПВИ (5-я группа) характерным явилось преобладание низкой вирусной нагрузки ВПЧ 16 типа (58,3 и 60,9%) и суммарной нагрузки (56,8 и 64,7% соответственно) (рис. 4). Таким образом, установлено не только преобладание высокой нагрузки при CINII-III, что согласуется с данными других исследований среди больных с тяжелым предраком и ранней стадией цервикального рака [Веснина Е.Л., 2007; Шипулина О.Ю. и соавт., 2008; Гаврикова М.В., 2010; Nam J.H. et al., 2011], но и сходство в уровне вирусной нагрузки ВПЧ при CINI и латентной форме инфекции. Наряду с ВПЧ–тестированием пациенткам исследуемых групп проводилась диагностика на наличие ИППП и условно–патогенную микрофлору в цервико–вагинальном биотопе (Chl. trachomatis, Mycoplasma genitalium, HSV 1-2, Ureaplasma spp.). Установлено, что для больных с предраком на фоне ВПЧ, в целом, не характерна ассоциация ВПЧ с другими микроорганизмами в сравнении с неинфицированными больными и пациентками с латентной формой ПВИ. Особенности же качественного состава микроорганизмов свидетельствуют о роли Chlamydia trachomatis, которая в отличие от других групп преобладала при CINII-III в сравнении с пациентками с латентной инфекцией (?=0,0706; р=0,03).

Рис.4. Вирусная нагрузка ВПЧ у больных с CIN и латентной инфекцией:

А – ВПЧ 16 типа, Б - суммарная вирусная нагрузка (16 и 18 типы)

Примечание: 1-я группа-1-я основная группа, 2-я группа -2-я основная группа, 5-я группа–3-я группа сравнения (латентная форма ПВИ)

Результаты кольпоскопии. При проведении расширенной кольпоскопии у больных с CIN установлено увеличение частоты регистрации аномальных кольпоскопических картин во 2-й группе (р<0,05). Выявлено преобладание частоты выраженных аномальных кольпоскопических картин у больных с CINII-III в зависимости от наличия ВПЧ, таких как грубая мозаика (?=0,1515, р=0,002) и атипичные сосуды (?=0,0025, р=0,046) при сравнении 2-й основной и 2-й группы сравнения. Для объективизации результатов кольпоскопии были использованы кольпоскопический индекс R. Reid (1993) и клинико–кольпоскопический индекс M. Shafi and Nazeer (2006). У больных с CINII-III на фоне ВПЧ закономерно чаще регистрировался высокий кольпоскопический индекс R. Reid (?=0,4085, р=0,001) и клинико–кольпоскопический индекс M. Shafi and Nazeer в отличие от инфицированных больных с CINI (?=0,1236, р=0,0003). Установлена статистически значимая корреляционная связь между показателями кольпоскопических индексов и степенью тяжести цервикального поражения (rs=+0,83; р<0,001 по R. Reid; rs=+0,79; р<0,001 по M. Shafi and Nazeer). Среди ВПЧ–позитивных больных с CINII-III установлен более высокий кольпоскопический индекс (р=0,047) и клинико–кольпоскопический индекс (р=0,099) в сравнении с неинфицированными пациентками с CINII-III, что свидетельствует о более выраженных кольпоскопических изменениях на фоне ПВИ (рис. 5).

?????????

1-я группа сравнения, 4 – 2-я группа сравнения

При CINI у ВПЧ-позитивных и ВПЧ-негативных больных по кольпоскопическим индексам статистически значимых различий не выявлено, что подтверждает тот факт, что наличие ВПЧ не влияет на выраженность кольпоскопических признаков на стадии CINI (табл. 1).

Таблица 1

Значение кольпоскопического индекса у больных с ВПЧ– ассоциированными CIN в зависимости от степени поражения (М±m), баллы

Индексы 1-я основная группа (n=50) 2-я основная группа (n=50) 1 группа сравнения (n=30) 2 группа сравнения (n=20)

R. Reid 1,12±0,09 5,0±0,20 #* 1,4±0,16 4,2±0,29 #

M. Shafi and Nazeer 1,46±0,16 5,88±0,29 # 1,7±0,19 5,05±0,31 #

Примечание: # р<0,05 при сравнении 1-й и 2-й групп, * р<0,05 при сравнении со 2-й группой сравнения

Результаты оценки онкобелка Е7. Инфицированным больным с CIN и пациенткам с латентной формой ПВИ при детекции ДНК ВПЧ 16 и /или 18 типа проводилось определение Е7 в цервикальных пробах методом ИФА (97 исследований). Позитивный тест на наличие Е7 зарегистрирован у больных 1-й (64,3±9,06%) и 2-й (83,3±6,80%) групп в сравнении с группой контроля (p<0,001), в которой наблюдались исключительно негативные результаты. У каждой второй пациентки с латентной ПВИ из группы сравнения подтверждено наличие Е7 (р=0,003) в сравнении с группой контроля. Статистически значимых различий по частоте обнаружения Е7 при сравнении основных групп больных не установлено (р=0,09), однако, если в 1-й основной группе повышение частоты Е7 относительно группы сравнения не являлось статистически значимым, то во 2-й основной группе преобладание Е7 носило значимый характер (р=0,01) (рис. 6). Полученные нами данные о более частом персистирующем течении ПВИ при высокой степени цервикального поражения согласуются с данными других исследователей, установивших повышение экспрессии онкобелка Е7 у женщин с CIN, более выраженное при CINIII и раке шейки матки [Н.П. Евстигнеева, 2006.; В.И. Киселев и соавт., 2011; D. Ehehalt et al., 2011].

Рис. 6. Частота определения онкобелка Е7 ВПЧ 16/18 типа у больных с CIN

Примечание: * р=0,09 при сравнении 1-й и 2-й основных групп ,** р=0,01 при сравнении 2-й основной группы и группы сравнения, ***р<0,01 при сравнении группы контроля с группами 1-й, 2-й и группой сравнения

При проведении корреляционного анализа Спирмена была обнаружена прямая средней силы статистически значимая корреляционная связь между степенью CIN и онкобелком Е7 (rs=+0,45, р<0,001). Установлена слабой силы корреляционная связь между кольпоскопическими индексами (по R. Reid и M. Shafi and Nazeer) и онкобелком Е7 у больных с ВПЧ–ассоциированными CIN(rs=+0,24, р=0,04 и rs=+0,25, р=0,03,соответственно) в сравнении с неинфицированными больными с CIN. Для онкобелка Е7 определены диагностическая чувствительность (72,3%), специфичность (67,9%), эффективность (70,7%), прогностическая ценность положительного результата (79,1%) и отрицательного результата (59,4%).

Результаты иммуноцитохимического исследования экспрессии биомаркеров p16ink4? и Ki-67. Изучение проведено среди пациенток с цервикальным предраком, латентной формой ПВИ и женщин группы контроля (n=75). Наряду с качественной (наличие позитивного теста), оценивалась количественная составляющая экспрессии (диффузная и фокальная) в виде единичных клеток и гиперэкспрессии р16, Ki-67, а также оценка коэкспрессии p16ink4? и Ki-67 (табл. 2).

Таблица 2


загрузка...