Применение нативных и генно-инженерных антигенов в качестве биолигандов в гидрозольных препаратах для экспрессной иммунодиагностики (17.09.2012)

Автор: Попова Светлана Валентиновна

Основные положения, выносимые на защиту:

Реакция гидрозоля, нагруженного соответствующим антигеном, может быть использована для обнаружения антител к вирусу гепатита у собак, вирусу H5N1 птичьего гриппа, M. Tuberculosis.

Реакция гидрозоля, нагруженного мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ, может быть использована для обнаружения антигена хорионического гонадотропина человека в тесте на беременность.

Реакция гидрозольной агглютинации при выявлении в сыворотке крови и капиллярной крови антител к M. Tuberculosis по своим основным характеристикам не уступает традиционным микробиологическим методам.

Гидрозоль на основе гексацианферрат (II) железа (III) обеспечивает наиболее оптимальный комплекс иммунохимических свойств разработанных тестов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена на кафедре общей химии ГБОУ ВПО КГМА в период с 2007 по 2012 г.г. Ряд исследований проведены на базах ОАО НПП «АВИВАК» (С.-Петербург); НИИ Гриппа РАМН (С.-Петербург); клинических лабораторий больниц: ФГУ ЛИУ – 12 по Кировской области и КОГБУЗ Кировской областной клинической больницы.

Объектами исследований являлись гидрозольные реагенты, используемые в реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА).

Для исследования нами были изготовлены гидрозоли, нагруженные нативными и генно-инженерными антигенами (с целью выявления антител в сыворотке крови) и мышиными моноклональными антителами к бета-субъединице ХГЧ (с целью обнаружения антигена), состав которых был следующим:

I. Твёрдофазные носители (табл. 1):

Таблица 1- Твердофазные носители в качестве основы для гидрозольных диагностикумов

№ Тип пигмента, формула Плотность,

г/см3 Размер частиц, нм Цвет

1. Гексацианоферрат (II) железа (III) или «берлинская» лазурь

Fe4[Fe(CN)6] 3 1,92 80-200 Синий

2. Оксид железа Fe3O4 4,73 200-500 Коричневый

II. Модификатор для твердой фазы гидрозольных диагностикумов HgCl2.

III. Биолиганды (табл. 2):

Таблица 2- Биолиганды, использованные в РГЗА

№ Тип биолиганда Область применения

1. Лизат антигенов гепатита псовых (Киров, ГСХА) Для диагностики инфекционного гепатита у животных.

2. Антигены вирусов гриппа (H5N1) (вируса птичьего гриппа), производства НИИ гриппа РАМН, Санкт - Петербурга Для диагностики птичьего гриппа

3. Рекомбинантные антигены туберкулёза, полученные с помощью генно-инженерных технологий (BL(DT3)/pCFP-ESAT), Покровский завод биопрепаратов, Владимирская область Для диагностики

туберкулёза

4. Комплексный туберкулезный антиген – диагностикум ППД производства Санкт - Петербургского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова Для диагностики

туберкулёза

5. Моноклональные антитела к бета-субъединице хорионического гонадотропина, ООО «Прогрес-сивные биомедицинские технологии», Москва Для диагностики беременности у женщин

Методика по изготовлению гидрозолей для исследования состояла из нескольких этапов. Сначала выполняли синтез твёрдых фаз: Fe4 [Fe(CN)6]3 и Fe3O4. Далее твёрдые фазы модифицировали 2% НgСl2, после чего осуществляли хемосорбцию исследуемых биолигандов.

Объекты исследований. Для исследования в качестве биологических материалов использовали гепаринизированную кровь подопытных привитых и непривитых животных, сыворотки крови больных людей с верифицированным диагнозом, сыворотки крови и мочу беременных женщин, сыворотки крови и мочу здоровых доноров в объёме 8 - 20 мкл. Сыворотку получали путём центрифугирования крови, допускалось взятие крови капиллярным способом.

Принцип реакции гидрозольной агглютинации (РГЗА) заключался в следующем: протекающая на молекулярном уровне реакция взаимодействия антигена с антителами должна приводить к развитию явлений, доступных наблюдению невооружённым глазом. Эту задачу удаётся решить, опираясь на факты множественности антигенных детерминант, а также на наличие двух областей связывания антигена у каждой молекулы антитела. Если частицы нагрузить антителами, то в силу бивалентности антител происходит их связывание или агглютинация. Образование даже небольших агрегатов приводит к их быстрому и хорошо заметному осаждению из суспензии. При смешивании разбавленных сывороток или крови с взвесью таких поливалентных частиц даже ничтожная концентрация антигена достаточна для возникновения заметной агглютинации. Она обнаруживает себя тем, что частицы не оседают на сферическое дно лунки планшета в виде маленького сгустка, а выстилает ровным слоем всю поверхность твёрдой фазы (лунок планшета). При визуализации реакции на фильтровальной бумаге «красная лента» мы получали следующую картину: при положительной реакции – плотный, компактный комплекс с чёткой границей; при отрицательной реакции – распределение частиц реагирующих веществ без чёткой границы в виде пятна.

Для постановки РГЗА использовали U-образные иммунологические планшеты, в лунках которых разводили и титровали сыворотки крови, капиллярную кровь, мочу брали без разведения. Затем вносили равные аликвоты гидрозоля, перемешивали с помощью пипеточного дозатора. Через 5-10 минут осуществляли регистрацию результатов в планшете и на пористом носителе - фильтровальной бумаге (рис. 1, 2).

U-образный планшет

А Б

Рис. 2. Визуализация результатов на фильтровальной бумаге

А – отрицательная сыворотка, Б – положительная сыворотка

Для сравнения мы применяли следующие референс-методы: микробиологические методы (микроскопия мазка и культуральный метод); хемилюминисцентный метод (анализатор CENTAUR); иммунохроматографический экспресс - метод (ИМХР) (тест-полоски с коллоидным золотом в качестве метки).

Полученные результаты обработаны статистическими методами. При сравнении качественных признаков применялся критерий Мак-Нимара, при помощи метода распределения ?2 (хи-квадрат) определяли теоретическую частоту положительных результатов эксперимента при равномерном распределении. Для выявления вида зависимости титра от концентрации применялся регрессионный анализ. Для определения диагностической ценности тестов использованных в работе, рассчитаны операционные характеристики: диагностическая чувствительность (Se), диагностическая специфичность (Sp). Для расчета использованы следующие формулы: Se =а/(а+с)*100%, Sp =d/(d+b)*100%, где а – истинноположительный результат, b – ложноположительный результат, с – ложноотрицательный результат, d – истинноотрицательный результат (J. Geerling, 1998).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование гидрозольных препаратов в задачах выявления

антител к вирусу гепатита псовых в сыворотке крови


загрузка...