ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ НАРУШЕНИЙ РЕГУЛЯЦИИ СИГНАЛИЗАЦИИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА STAT6 ПРИ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ (16.11.2010)

Автор: Сорокина Лада Николаевна

Для идентификации полиморфного варианта rs324011 гена была использована методика полимеразной цепной реакции с ДНК, выделенной из клеток периферической крови, последующей рестрикцией, и анализом количества и длины получившихся отрезков ДНК с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Праймеры для фрагмента 2 интрона гена STAT6 были разработаны на основе известной последовательности 12 хромосомы AC018673 (GenBank). Продукт амплификации размером 216 нуклеотидов обрабатывался эндонуклеазой Ava II (Есо47I, Fermentas).

Для анализа результатов исследований была разработана специальная база данных на основе программы SPSS для Windows (Statistical Package for the Social Science for Windows) (русифицированная версия 13.0).

Статистическую обработку результатов исследований (определение числовых характеристик выборок, оценку значимости различия оцениваемых параметров методами параметрической и непараметрической статистики, корреляционный анализ) проводили в соответствии с рекомендациями по обработке результатов медико-биологических исследований (Гланц М., Стентон А., 1992). Заключение о статистической значимости давалось при уровне вероятности ошибочного заключения не менее 0,05. Вся математическая обработка проводилась на ПЭВМ – Pentium.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

По современным представлениям о патогенезе БА, ведущая роль отводится изменению функций мембранно-рецепторного аппарата клетки и сигнальных систем, которые рассматриваются как центральный дефект не только иммунного, но и эффекторного звеньев аллергических реакций (Минеев В.Н., 2005; Федосеев Г.Б., Трофимов В.И., 2006).

Предполагается, что при БА наблюдается сдвиг в сторону Th2-иммунного ответа, с активацией IL-4 пути сигнализации. Взаимодействие IL-4 и/или IL-13 с рецептором приводит к активации соответствующих Янус-киназ JAK1 и JAK3, которые фосфорилируют STAT6-мономер (неактивный белок), превращая его в pSTAT6-димер (активный белок), с последующей транслокацией его в ядро, для участия в транскрипции. В контексте вышеизложенного, наиболее важным нам представлялось изучение особенностей экспрессии одного из ключевых в патогенезе БА компонентов JAK-STAT-сигнализации – транскрипционного фактора STAT6 и нарушения основных механизмов его регуляции при этом заболевании.

ключевым звеном в IL-4 сигнальном каскаде.

Так, ранее (Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., 2007) было обнаружено повышение экспрессии STAT6, а также повышенный уровень активной (фосфорилированной) формы его (pSTAT6) в мононуклеарах периферической крови больных АБА (изобретение “Способ дифференциальной диагностики БА”; авторы: Минеев В.Н., Сорокина Л.Н., Трофимов В.И.; решение о выдаче патента на изобретение от 12.02.2010 по заявке № 2008151226/15).

Нами выявлено повышение уровня экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови (при АБА 0,83±0,66; n=52; при НАБА 0,72±0,4; n=44 и в группе практически здоровых лиц 0,17±0,16; n=20; p=0,0001; критерий Геймса-Хоуэлла), а также значительное увеличение разработанного нами интегрального коэффициента STAT6/STAT4 у больных БА по сравнению с группой практически здоровых лиц (при АБА 1,7 (1,17; 8,2); при НАБА 1,01 (0,75; 1,8) и в группе практически здоровых лиц 0,11 (0,08; 0,33); p=0,0001; U-критерий Манна-Уитни).

Выявленный факт не удивителен, поскольку STAT6 является одним из основных компонентов в Th2-дифференцировке Т-лимфоцитов, создавая, тем самым, предпосылки для развития Th2-сдвига при БА (Elias J.A., Chun Geun Lee, Tao Zheng et al., 2003; Barnes J.P., 2008). При этом в фазе ремиссии заболевания отмечается снижение уровня экспрессии STAT6 как у больных АБА (в фазе обострения 0,79±0,38; в фазе ремиссии 0,55±0,17; p=0,015; t-критерий парных выборок Стьюдента), так и у больных НАБА (в фазе обострения 0,67±0,4; в фазе ремиссии 0,38±0,22; p=0,044; t-критерий парных выборок Стьюдента).

Исходя из выше изложенного, можно заключить, что АБА отличается наиболее высокими уровнями экспрессии STAT6 и интегрального коэффициента STAT6/STAT4. В этой связи интересны данные литературы, констатирующие наибольшую активность IL-4-сигнализации в бронхах именно при данном варианте заболевания (Christodoulopoulos P., Cameron L., Nakamura Y. et al., 2001).

В частности, при иммуногистохимическом исследовании ткани бронхов больных БА (Christodoulopoulos P., Cameron L., Nakamura Y. et al., 2001) определялось более высокое содержание клеток, экспрессирующих STAT6, у больных АБА в сравнении с НАБА. В этой связи представляется интересным наличие и направленность выявленных нами корреляционных связей между уровнями экспрессии транскрипционного фактора STAT6 и процентным содержанием эозинофилов в мокроте: у больных АБА указанная корреляционная связь является положительной (r (Спирмен) = 0,4; p = 0,03; n=29), в то время как у больных НАБА она становится отрицательной (r (Спирмен) = 0,41; p = 0,029; n=29).

В условиях активации мононуклеаров периферической крови IL-4 существенное снижение уровня экспрессии STAT6 отмечается только у больных АБА (0,66±0,58; p=0,002; t-критерий пaрных выборок Стьюдента), что может свидетельствовать о более активном расходовании неактивной формы этого транскрипционного фактора на формирование STAT6-димеров в процессе активации сигнального пути у больных этой группы. В то же время у больных АБА нами выявлена наиболее высокая способность STAT6 к активации IL-4 (при АБА уровень pSTAT6: исходный 0,25±0,2; в условиях активации IL-4 – 1,71±1,18; n=52; p<0,05; t-критерий пaрных выборок Стьюдента; при НАБА уровень pSTAT6: исходный 0,23±0,2; в условиях активации IL-4 – 0,82±0,4; n=44; p<0,05; t-критерий пaрных выборок Стьюдента).

Нами также выполнено определение концентрации pSTAT6 на иммуноанализаторе Bio-Plex (Bio-Rad, США) по методу проточной флюориметрии. В условиях активации IL-4 отмечалось значительное нарастание фосфорилированной формы (активной) транскрипционного фактора STAT6 во всех обследованных группах, которое было существенно выше у больных АБА в сравнении с НАБА (p=0,001). Представляют интерес выявленные нами положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии транскрипционного фактора STAT6 в мононуклеарах периферической крови (по методу иммуноблоттинга) и концентрацией pSTAT6 (по методу проточной флюориметрии) исходно (r (Пирсон) = 0,5; p = 0,05; n=16) и в условиях активации IL-4 (r (Пирсон) = 0,65; p = 0,006; n=16).

Необходимо подчеркнуть, что максимальная активация данного сигнального пути в мононуклеарах периферической крови наблюдается у больных АБА, что согласуется с данными литературы (Walker C., Bauer W., Braun R.K. et al., 1994; Mullings R.E., Wilson S.J., Puddicombe S.M. et al., 2001; Diel F., Borck H., Horr B., 2004).

Следует обратить внимание, что повышенную способность к активации IL-4 мононуклеары периферической крови больных АБА сохраняют как в фазе обострения, так и в фазе ремиссии заболевания, что может указывать на повышенную Th2-активность при АБА.

У больных НАБА уровень экспрессии STAT6 имеет зависимость от тяжести течения заболевания (p<0,05; критерий Тьюки), что согласуется с данными литературы о повышении уровня экспрессии STAT6 в бронхиальном эпителии у больных тяжелой БА, которые получали ингаляционные и пероральные глюкокортикостероиды (Mullings, R.E., Wilson S.J., Puddicombe S.M et al., 2001). Отметим, что у больных АБА подобной зависимости не выявлено (p>0,05; критерий Геймса-Хоуэлла), что, вероятно, может косвенно свидетельствовать о генетически детерминированном повышении экспрессии данного транскрипционного фактора в рамках концепции существования биологических дефектов при аллергической патологии.

При этом обращают на себя внимание выявленные нами отрицательные корреляционные связи между уровнем экспрессии STAT6 в мононуклеарах периферической крови и ОФВ1 (r (Пирсон) = - 0,32; n=97; p=0,001) и индексом Тиффно (r (Пирсон) = - 0,28; n=97; p=0,006) (Kuperman D., Schofield B., Wills-Karp M. et al., 1998), а также, положительная между уровнем экспрессии STAT6 и суточной дозой парентеральных глюкокортикостероидов (r (Кендалл) = 0,2; n=92; p=0,011). Вполне закономерно наличие отрицательной корреляционной связи, характеризующей тяжесть течения БА, между ОФВ1 и суточной дозой вводимых парентеральных глюкокортикостероидов (r (Пирсон) = - 0,26; p = 0,004; n=119) и между индексом Тиффно и суточной дозой вводимых парентеральных глюкокортикостероидов (r (Пирсон) = -0,26; p = 0,004; n=119), что указывает на увеличение потребности в системных глюкокортикостероидах при утяжелении заболевания и нарастании бронхиальной обструкции.

Таким образом, можно предположить, что полученные нами изменения экспрессии STAT6 связаны с клинико-патогенетическими особенностями БА и, вероятно, отражают концепции генетической детерминированности биологических дефектов, а также, гетерогенности и комплексности нарушений регуляции сигнальных систем при этом заболевании.

Анализ еще одного транскрипционного фактора, участвующего в развитии Th2-фенотипа, - GATA-3 – показал, что для больных АБА (0,37 (0,14; 0,73)) характерно повышение экспрессии данного транскрипционного фактора в мононуклеарах периферической крови, вне зависимости от фазы заболевания, по сравнению с его уровнем у практически здоровых лиц (0,2 (0,06; 0,44); p=0,038; U-критерий Манна-Уитни) и больных НАБА (0,21 (0,04; 0,39); p=0,004; U-критерий Манна-Уитни). Это согласуется с данными литературы о нарастании экспрессии GATA-3 при аллергической патологии (Arakawa S., Hatano Y., Katagiri K., 2004; Taha R., Hamid Q., Cameron L. et al., 2005).

., 2008; Caramori G., Groneberg D., Ito K., Casolari P. et al., 2008).

???$??????

???$??????

играть патогенетическую роль в утяжелении заболевания.

При этом, для больных АБА, получающих пероральную терапию глюкокортикостероидами, характерно значимое нарастание экспрессии GATA-3 (0,87±0,6), по сравнению с больными, вообще не получавшими данной терапии (0,32±0,26; p=0,048; критерий Тьюки).

В этой связи представляется важным наличие существенной положительной корреляционной связи между уровнем экспрессии GATA-3 и тяжестью течения заболевания у больных АБА ((r (Спирмен) = 0,36; p = 0,018; n=42), а также, выявленной нами значимой отрицательной корреляционной связи между уровнем экспрессии GATA-3 и ОФВ1 (r (Пирсон) = - 0,33; p = 0,035; n=42) и индексом Тиффно (r (Пирсон) = - 0,34; p = 0,029; n=41), что позволяет предполагать значение данного транскрипционного фактора в нарастании тяжести течения АБА.

Итак, выявленное повышение экспрессии GATA-3 в мононуклеарах периферической крови может являться важным фактором в патогенезе БА и, по-видимому, маркерным показателем атопии у больных АБА, а также, в определении механизмов утяжеления данного заболевания.

Обсуждая механизмы формирования нарушений Th2-сигнализации в рамках патогенеза БА, важно рассмотреть вопрос об изменениях, одновременно происходящих в альтернативной системе (рис. 2) Th1-сигнализации, одним из ключевых компонентов которой является транскрипционный фактор STAT4, поскольку установлено, что в отношении Th1 и Th2 дифференцировки существует перекрестная регуляция (Kaplan M.H., Sun Y.L., Hoey T., Grusby M.J., 1996; Kaplan M.H., Schindler U., Smiley S.T., Grusby M.J., 1996), которая заключается во взаимном угнетении ее компонентов при активации альтернативного пути дифференцировки (Wurster A.L., Tanaka T., Grusby M.J., 2000). Известно также, что STAT4 может напрямую вызывать трансактивацию цитокина IFN-? (Xu X., Sun Y.L. Hoey T., 1996).

Рис. 2. Схема механизмов альтернативной регуляции баланса Th1/Th2-клеток.

Нами выявлено выраженное (в 2,4 раза) снижение уровня экспрессии STAT4 (p=0,008; критерий Тьюки) и снижение (в 1,9 раза) экспрессии мРНК IFN-? (p=0,008; критерий Тьюки) у больных АБА по сравнению с группой практически здоровых лиц, что может указывать на нарушение механизмов сигнализации в альтернативном IL-12-сигнальном пути.

В то же время повышение уровня экспрессии STAT4 в мононуклеарах больных БА, получающих терапию глюкокортикостероидами, наиболее выраженное в группе больных с парентеральной (0,57±0,43) и пероральной терапией глюкокортикостероидами (0,61±0,6) по сравнению с группой больных БА, вообще не получающих терапию глюкокортикостероидами (0,28±0,2; p<0,05; критерий Геймса-Хоуэлла), следует рассматривать, на наш взгляд, как положительный фактор восстановления регуляторной роли альтернативного IL-12-сигнального пути.

В этой связи интересны данные литературы, свидетельствующие о снижении продукции Th2-цитокинов и уменьшении гиперреактивности бронхов в результате активации STAT4-сигнализации (Raman K., Kaplan M.H., Hogaboam C.M. et al., 2003; Matsubara Sh., Takeda K., Kodama T. et al., 2006). Примечательно, что уровень экспрессии мРНК IFN-? у больных БА, получающих терапию системными глюкокортикостероидами, также существенно выше, чем у больных, не получающих указанную терапию.

Проведенные ранее исследования показали, что введение экзогенного IFN-? приводило к уменьшению эозинофилии в дыхательных путях и к уменьшению гиперреактивности бронхов в ответ на провокацию аллергеном (Iwamoto I., Nakajima H., Endo H., Yoshida S., 1993). При этом следует добавить, что специфическая иммунотерапия (Durham S.R., Till S.J., 1998), а также, терапия глюкокортикостероидами (Bentley A.M., Hamid Q., Robinson D.S., 1996) приводят к повышению продукции IFN-? циркулирующими Т-лимфоцитами.

В результате анализа уровней цитокинов в плазме крови выявлены существенные различия в их концентрациях (пг/мл): у больных АБА преобладают Th2-цитокины, а у больных НАБА - Th1-цитокины.

Важным аспектом является также факт подавления транскрипционных факторов STAT4 и T-bet на фоне избыточной экспрессии GATA-3 (Hwang, E.S., S.J. Szabo, P.L. Schwartzberg, L.H. Glimcher, 2005; Barnes P.J., 2008). При этом положительные корреляционные связи между уровнем экспрессии STAT4 в мононуклеарах периферической крови и сопутствующей кардиальной (r (Спирмен) = 0,37; p = 0,001; n=75) и гастроэнтерологической (r (Спирмен) = 0,41; p = 0,0001; n=75) патологией позволяют косвенно свидетельствовать об участии его в патогенезе этих заболеваний. Так, установлена повышенная экспрессия STAT4 при ишемической болезни сердца (Methe H., Brunner S., Wiegand D. et al., 2005) и при патологии желудочно-кишечного тракта (Pang Y.H., Zheng C.Q., Yang X.Z., Zhang W.J., 2007; Martinez A., Varade J., Marquez A., 2008). И, напротив, отрицательная корреляционная связь между уровнем экспрессии STAT4 и наличием аллергического ринита (r (Спирмен) = - 0,23; p = 0,049; n=75) заставляет предполагать преимущественное вовлечение в процесс аллергического воспаления Th2-сигнального пути.

Таким образом, полученные нами данные, описывающие снижение у больных АБА как уровня экспрессии белка STAT4, так и уровня экспрессии мРНК IFN-?, который, может являться результатом активации STAT4, представляются, на наш взгляд, существенными и указывают на нарушение всего IL-12-сигнального пути.

Продолжая рассмотрение изменений в альтернативной системе Th1-сигнализации при БА, необходимо обсудить роль транскрипционного фактора T-bet и его место в патогенезе БА. Данный транскрипционный фактор может смещать баланс между Т-хелперами 1-го и 2-го типов в сторону превалирования Th2, обусловливая патогенетические предпосылки для развития уже в детском возрасте таких аллергических заболеваний, как БА.

При АБА вне зависимости от фазы заболевания в мононуклеарах периферической крови нами выявлено выраженное снижение (в 7,2 раза) уровня экспрессии T-bet (p=0,002; критерий Тьюки) по сравнению с группой практически здоровых лиц. У больных НАБА существенных различий экспрессии T-bet (0,8±0,56) по сравнению с группой практически здоровых лиц (0,69±0,53; p>0,05; критерий Тьюки) не выявлено.

Следует отметить, что в легких больных БА снижено количество CD4+ клеток, экспрессирующих данный ген (TBX21) по сравнению с практически здоровыми лицами (Szabo S.J., Kim S.T., Costa G.L. et al., 2000; Finotto S., Neurath M.F., Glickman J.N. et al., 2002).


загрузка...