ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS) И БЛОХ (SIPHONAPTERA) (на примере сибирских природных очагов чумы) (16.02.2009)

Автор: Базанова Любовь Петровна

Материалы диссертации включены в нормативно-методические документы федерального и регионального уровня: «Методические рекомендации по повышению результативности исследований эктопаразитов в природных очагах чумы» (Иркутск, 1990), «Паспорт Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2000), «Методические указания. Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих – переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций» (М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2002), «Методические рекомендации по эпизоотологическому обследованию Тувинского природного очага чумы» (Иркутск, 2004), «Методические рекомендации по лабораторному разведению блох для научных исследований» (Саратов, 2007).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В сибирских горных природных очагах чумы, несмотря на их различные характеристики по гостальности и векторности, основным механизмом поддержания энзоотии является трансмиссия чумного микроба инфицированными «неблокированными» блохами.

2. Блокообразование как специфический способ передачи чумного микроба блохами имеет выраженную сезонную динамику, обусловленную половыми и возрастными особенностями эктопаразитов и адаптацией к ним возбудителя. Наиболее активен этот процесс в пик эпизоотии в природном очаге.

3. Второстепенные способы передачи чумного микроба блохами могут быть в определенных условиях эффективными и играть существенную роль в циркуляции микроба в природных очагах Сибири.

4. Возможно установление функциональных контактов между чумным микробом и переносчиками из географически разобщенных популяций (из разных природных очагов), а также между возбудителем и блохами, никогда не контактировавшими с чумным микробом (насекомые с неочаговых территорий и межподвидовые гибриды блох). Адаптация Yersinia pestis к экологическим особенностям блох увеличивает способность микроба приживаться в их организме, о чем свидетельствует связь уровня ФА билатеральных признаков насекомых с частотой блокообразования.

5. Агрегированность чумного микроба является функцией его адаптации к организму блох и отражает векторную способность переносчиков.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на научно-практической конференции «Профилактика природноочаговых инфекций» (Ставрополь, 1983); Х конференции Украинского общества паразитологов (Киев, 1986); X Съезде Всесоюзного энтомологического общества (Ленинград, 1989); региональном совещании противочумных учреждений по эпидемиологии, эпизоотологии и профилактике особо опасных инфекций (Уральск, 1989); межгосударственной научно-практической конференции «Организация эпиднадзора при чуме и меры ее профилактики» (Алма-Ата, 1992); региональной научно-практической конференции «Проблемы природноочаговых инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке» (Чита, 1993); научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 1998); IY международном симпозиуме по блохам (Казахстан, Алматы, 1999); Первой международной юбилейной конференции «Актуальные проблемы инфектологии и паразитологии» (Томск, 2001); юбилейной научно-практической конференции «Эпидемиологическая безопасность на Кавказе», посвященной 50-летию Ставропольского НИПЧИ (Ставрополь, 2002); научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и YIII съезде Итало-Россйского общества по инфекционным болезням (Санкт-Петербург, 2002); международной конференции «Проблемы современной паразитологии» и III съезде Паразитологического общества при РАН (Петрозаводск, 2003); конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра (Москва, 2004); YII межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ» (Оболенск, 2005); I Всероссийском совещании по кровососущим насекомым (Санкт-Петербург, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Синантропизация растений и животных» (Иркутск, 2007); YIII межгосударственной научно-практической конференции государств-участ-ников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007).

Личный вклад соискателя. Лабораторные эксперименты и полевые исследования, а также анализ материалов проведены при непосредственном участии автора. На полевые исследования затрачено 275 дней, на экспериментальные (работа с зараженным материалом) – 2006 дней, из них 739 непосредственно в природных очагах чумы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 72 работы, в том числе 32 в научных журналах и изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций, 40 – в других журналах, научных трудах и материалах международных, всесоюзных, региональных конференций (на русском, английском, китайском и монгольском языках).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 325 страницах, иллюстрирована 35 рисунками и 60 таблицами. Список использованной литературы включает 488 источников, из них 121 в иностранных изданиях.

Благодарности. Автор признателен за помощь и поддержку администрации и сотрудникам зоолого-паразитологического, эпидемиологического отделов, лаборатории экспериментальных животных Иркутского научно-иссле-довательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока, специалистам Тувинской противочумной станции. Искренне благодарю Т.И. Иннокентьеву, А.Г. Трухину, Ю.Д. Очирова, М.П. Маевского, А.Я. Никитина, А.Ф. Попкова, В.Т. Климова, Д.Б. Вержуцкого, Е.А. Вершинина, В.М. Корзуна, Е.Г. Токмакову, Е.А. Чипанина, Г.А. Воронову за разнообразную помощь в проведении исследований и подготовке диссертации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

О ВЗАИМООТНОШЕНИЯХ ЧУМНОГО МИКРОБА И БЛОХ

(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Рассмотрены представления о природном очаге чумы как экологической системе (Павловский, 1947, 1960, 1964; Беклемишев, 1956; Балашов, 1972; Korenberg, 1982, 1989; Коренберг, 1983, 1985, 1986; Леви, 1985; Литвин и др., 1998; Литвин, Коренберг, 1999; Атшабар, 1999), особенностях взаимоотношений чумного микроба и блох (Pollitzer, 1954; Иофф, 1941; Бибикова, Классовский 1974; Алексеев, 1989; Ващенок, 1999; Анисимов и др., 2002; Anisimov et al., 2004; Hinnebusch, 2005), состоянии агрегированности (биопленке) микроба в организме блохи, а также значении этого явления в трансмиссии (Burrows, Bacon, 1956; Акиев, 1970, 1991; Бурделов, 1987; Ващенок, 1988; Брюханова и др., 1989, 1999; Hinnebusch et al., 1998, 2002; Jarret et al., 2004; Duplantier et al., 2005; Erickson et al., 2006).

В 80-х годах прошлого века факты длительных межэпизоотических периодов в отдельных природных очагах чумы, одномоментности возникновения эпизоотий на разных участках, регистрации одиночных заражений носителей стали вступать в противоречие с традиционными представлениями о постоянном сохранении и непрерывной циркуляции чумного микроба в паразитарной системе. Это привело к обоснованию концепции «первичных» заражений, не связанных с трансмиссией (Попов и др., 1979; Солдаткин, Иванов, 1980; Мастюков и др., 1980; Солдаткин и др., 1984), и мысли о необходимости пересмотра традиционных взглядов на передачу чумы блохами как основного фактора поддержания энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988). Кризис идеи трансмиссивного механизма породил большое количество гипотез, основанных как на внутривидовой изменчивости чумного микроба (Дунаев и др., 1981, 1982; Дятлов, 1988, 1989; Ларина и др., 1992), так и «непаразитарном» механизме энзоотии (Солдаткин, Руденчик, 1988; Домарадский, 1993; Слудский, 1998; Попов, 2002; Слудский и др., 2003). Факты зараженности нематодами личинок и имаго блох (Чумакова, Товканев, 1978; Чумакова, Козлов, 1983, 1984) привлечены для объяснения хранения и передачи возбудителя из почвенного биоценоза теплокровным животным по цепочке: матрикс биопленки чумного микроба – личинка нематоды – личинка блохи – грызун (Попов и др., 2006; Попов и др., 2007; Попов и др., 2008). Большинство гипотез, объясняющих длительные межэпизоотические периоды в отдельных очагах чумы нетрансмиссивными способами передачи возбудителя, до настоящего времени не получили прямого подтверждения или доказательства. Напротив, многочисленные экспериментальные данные, результаты эпизоотологических наблюдений в природных очагах свидетельствуют об определяющей роли блох в поддержании чумной энзоотии и обосновывает необходимость дальнейших исследований особенностей их взаимоотношений с чумным микробом (Леви, 1985; Бурделов, 1987; Сулейменов, 1995; Кокушкин, 1995; Анисимов и др., 2002; Eisen et al., 2006, 2007; Wilder et al., 2008).

Даны основные характеристики сибирских природных очагов чумы, особенности их биоценотической структуры и эпизоотических проявлений на очаговой территории (Голубинский и др., 1987; Вершинин, 1993; Иннокентьева, 1997; Вержуцкий, 2005; Корзун, 2007).

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Районы работ и объекты изучения. Полевые исследования проведены в 1974-1994 гг. на базе стационаров и эпидотрядов Читинской, Тувинской и Алтайской противочумных станций (ПЧС). Экспериментальные исследования выполнены в 1985-2007 гг. на базе паразитологического, эпидемиологического отделов и лаборатории экспериментальных животных Иркутского научно-исследовательского противочумного института (НИПЧИ). Основной объем работ в условиях природного очага выполнен на базе экспериментальной лаборатории Тувинской ПЧС вблизи пос. Мугур-Аксы Республики Тыва.

В экспериментах использованы лабораторные культуры блох и насекомые природных популяций. Блохи диких грызунов получены из биотопов долин рек Каргы и Барлык Тувы, природных стаций Юго-Восточного Забайкалья (падь Крементуй, район Торейских озер), Ольхонского района (Тажеранская степь), окрестностей пос. Усть-Орда Усть-Ордынского Бурятского автономного округа, Республики Бурятия (Тункинская долина, окрестности пос. Никольское). Опыты также проведены с Xenopsylla cheopis как классическим объектом экспериментальных исследований. Для заражения эктопаразитов, мелких млекопитающих и лабораторных животных использовали штаммы Y. pestis subsp. pestis, Y. pestis subsp. altaica, Y. pestis subsp. ulegeica из природных очагов Сибири (Тувинского, Горно-Алтайского, Забайкальского) и Монголии (Баян-Улэгейский и Хэнтейский аймаки). Поставлено 108 опытов, использовано 25500 блох 13 видов и подвидов, 1746 зверьков четырех видов и 13 штаммов чумного микроба.

Методы исследований взаимоотношений чумного микроба с блохами. Лабораторное разведение эктопаразитов для экспериментальных исследований осуществляли в инсектарии НИПЧИ и на базе Тувинской ПЧС (Методические рекомендации ..., 1983; Кондрашкина и др., 1984). В качестве прокормителей блох использовали золотистых хомячков и белых мышей.

В опыты брали в основном «молодых», питавшихся после выплода имаго. Применяли два способа заражения переносчиков чумным микробом. При естественном способе блох инфицировали на длиннохвостых сусликах, монгольских пищухах, плоскочерепных полевках, белых мышах в период развития у них агональной чумной бактериемии. При искусственном заражении на биомембране для кормления насекомых использовали смесь равных частей дефибринированной крови морской свинки и 2 млрд. взвеси чумного микроба из 48-часовой агаровой культуры, выращенной при 28? С. Между подкормками насекомых содержали в стерильном песке при соответствующей задачам опыта температуре и относительной влажности воздуха 80-93 %.

Взаимоотношения чумного микроба и блох оценивали по доле особей с «блоком» преджелудка от количества насекомых при первой подкормке, количеству всех особей за подкормку со сформировавшимися бактериальными «глыбками-конгломератами», частоте передачи чумного микроба животным, использованным для подкормок насекомых. Алиментарную активность определяли по доле пивших особей от числа живых, а смертность – по доле мертвых от общего количества эктопаразитов при каждой подкормке.

Сезонные особенности трансмиссии чумного микроба блохами изучали при разной температуре содержания насекомых, близкой к естественной температуре воздуха во время периода исследования. В опытах, поставленных при температуре от 5° до 27° С, использованы насекомые разных, условно выделенных календарных возрастов: «перезимовавшие», инфицированные летом или осенью предыдущего года и зимовавшие без прокормителя в условиях искусственной норы длиннохвостого суслика, и «молодые» – выплода и инфицирования текущего года. Преимущественно в эти эксперименты взяты особи II и III физиологических возрастов по шкале В.Н. Прокопьева (1958).

Активность трансмиссии оценивали по доле «блокированных» блох и всех особей, содержащих конгломераты микроба, относительному количеству инфицированных сусликов и среди них с генерализованной формой инфекции. Инфекциозность укусов «блокированных» блох определяли путем ежедневного кормления 1-3 таких особей на суслике в течение 1,5-2 часов, используя при каждой подкормке интактного зверька. В отдельном опыте эктопаразитов содержали в термостате при 25-27? С, исходя из данных О.Ф. Пауллер и В.Е. Мамаева (1954), что в центре жилого гнезда даурского суслика температура колеблется от 16? до 34? С, а в среднем равняется 26,7? С.

Изучение длительности сохранения чумного микроба C. tesquorum altaicus проводили по разработанной нами методике (Базанова, 1993). Зараженных имаго помещали в стаканчики-гильзы из органического стекла, дно и крышка которых выполнены из асбестового стерилизующего фильтра, обеспечивающего свободный доступ воздуха. «Гильзы» закладывали в ниши бункера, имитирующие гнездовую камеру суслика. Температуру и влажность воздуха измеряли перед началом опыта, в середине и в момент изъятия насекомых из «гнезда». За время проведения эксперимента температура колебалась от +2? С до -6? С. Между подкормками блох содержали: осенью и весной при 5-6? С, летом при 8-10? С. Общая продолжительность эксперимента составила 692 дня (с 14 сентября 1987 г. по 7 августа 1989 г.).

Заражение длиннохвостого суслика алиментарным способом проводили путем нанесения на слизистую рта зверька суспензии из 1-5 инфицированных блох. Возможность заражения суслика возбудителем чумы через поврежденную кожу устанавливали, втирая раздавленных насекомых или их экскременты в предварительно скарифицированную кожу зверька. Исследовали длительность сохранения чумного микроба в инфицированном экскрементами и трупами эктопаразитов субстрате гнезда. Для этого использовали смесь из равных частей песка и мелких опилок, где содержали зараженных насекомых в период между подкормками. Такой субстрат хранили в течение 8-9 месяцев в специальных нишах лаборатории-бункера, имитирующих нежилые гнезда суслика, а затем использовали для заражения сусликов в виде подстилки. Суспензии из трупов блох высевали на экспериментальные серии сред: УДС (универсальная диагностическая среда) и ЛС (среда для выделения Л-форм чумного микроба). Суспензию из субстрата высевали на среду УДС; этим же материалом заражали белых мышей подкожно или внутрибрюшинно.

Изучение межпопуляционных особенностей взаимоотношений переносчиков с чумным микробом. Исследование проведено на двух массовых видах блох длиннохвостого суслика C. tesquorum altaicus и Rhadinopsylla li transbaikalica из Каргинской и Барлыкской природных популяций Тувинского очага чумы. Взаимоотношения с чумным микробом оценивали по уровню инфицирования насекомых, накоплению в их организме микроба в агрегированном состоянии и образованию «блока» при заражении и подкормках на длиннохвостом суслике. Кроме того, изучали особенности взаимоотношений C. tesquorum altaicus лабораторной популяции, полученной от блох с Каргинского участка очаговости, и чумного микроба, изолированного в Саглинском и Каргинском участках Тувинского очага (штаммы Y. pestis И-3327 и И-3428) при искусственном заражении и подкормках блох на белых мышах.

При исследовании уровня флуктуирующей асимметрии (ФА) у C. tes-quorum внутри каждого варианта опыта сопоставляли две группы блох: одна – особи со сформировавшимся «блоком» преджелудка, другая – те, у которых в течение опыта «блок» не был отмечен. Оценивали признаки: число щетинок на эпистерне (1), метэпимере (2), наружной поверхности бедра (3), внутренней поверхности бедра (4), наружной поверхности голени (5) с правой и левой стороны тела имаго. Уровень ФА характеризовали через показатель дисперсии разности в проявлении признака с двух сторон тела (?d2), а также путем расчета доли асимметричных имаго в проанализированной выборке.

Изучение особенностей взаимоотношений блох и чумного микроба из географически разобщенных популяций проведено на массовых видах эктопаразитов монгольской пищухи, длиннохвостого суслика и штаммах возбудителя, полученных из разных природных очагов.

Изучение особенностей взаимоотношений чумного микроба с блохами, исторически не имевшими контакта с возбудителем, выполнено на имаго C. tesquorum и Frontopsylla luculenta с неочаговых территорий, а также гибридах F1, F3, F4 двух подвидов C. tesquorum (C. tesquorum altaicus и C. tesquorum sungaris). В серии экспериментов изучали способность насекомых к инфицированию, «блокированию» чумным микробом и его передаче зверькам.

Исследование инфицированных блох проводили:

1. Визуально путем микроскопирования после каждой подкормки на животном выявляли блох с бактериальными «глыбками», частичными и полными «блоками». Учет средней за подкормку доли насекомых, содержащих микроб в различной степени агрегированности, позволил провести сравнительный анализ динамики взаимоотношений переносчика и возбудителя.

2. Исследовали содержимое желудочно-кишечного тракта блох путем свето-оптического, фазово-контрастного и электронного микроскопирования. Мазки для исследования на светооптическом уровне готовили по методике А.П. Бейер с соавт. (1974). Ультратонкие срезы преджелудка, приготовленные согласно методическим рекомендациям (Волгоград, 1983) и (Саратов, 1989), просматривали в электронном микроскопе Jem 100 SX (JeOL, Япония). Проводили фильтрацию суспензии из содержимого желудков инфицированных блох через мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и высев полученных фильтратов на стандартные питательные среды, а также среду для культивирования Л-форм чумного микроба.

3. Для детекции микроба в насекомых использованы бактериологический и молекулярно-биологический – постановка полимеразной цепной реакции (ПЦР) методы. Подробно методики подготовки блох к исследованию и постановки ПЦР изложены в работах (Балахонов и др., 1998, 1999, 2000).

4. Взаимоотношения блох и чумного микроба исследовали с учетом эколого-физиологических особенностей насекомых: сроков важнейших сезонных явлений в их жизни, возрастного и полового состава опытных групп, алиментарной активности, смертности, продолжительности жизни.

Исследование зверьков, использованных для кормления инфицированных насекомых. Манипуляции с животными проводили с соблюдением правил, принятых Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей (Страсбург, 1986). Факты передачи чумного микроба животным устанавливали бактериологическим (посев органов на стандартные среды или среду для Л-форм чумного микроба), биологическим (заражение биопробы суспензией из органов животных) и серологическим (реакция пассивной гемагглютинации – РПГА, реакция нейтрализации антител – РНАт и реакция нейтрализации антигена – РНАг) методами исследования. Часть опытных животных, на которых кормили «перезимовавших» блох и без видимого «блока», дополнительно исследовали в иммунологических тестах: определяли показатель повреждения нейтрофилов (ППН) по методу В.А. Фрадкина (1962), исследовали органы с помощью радиоиммуного анализа (РИА).

Статистическая обработка экспериментальных данных. Статистическую обработку проводили с помощью стандартных методов (Рокицкий, 1967; Закс, 1976; Поллард, 1982; Боровиков, Ивченко, 2000; Боровиков, 2001; Никитин, Сосунова, 2003) с применением программы «Excel». Различия между двумя группами по средним показателям оценивались с применением критерия Стьюдента, по изменчивости – F критерия. Использованы методы регрессионного, дисперсионного и корреляционного анализов и метод множественных сравнений по Шеффе. В работе приняты стандартные уровни значимости: * – P<0,05; ** – P<0,01; *** – P<0,001.


загрузка...