Роль прогениторных клеток костного мозга в ремоделировании левого желудочка при хронической сердечной недостаточности (16.01.2012)

Автор: Фатхудинов Тимур Хайсамудинович

клеток

(млн. кл./кг) Объем

(мл/кг) Конц.

(кл./мл)

Срок выведения из эксперимента (сут)

1 14 30 60

Контроль Физиологический раствор 0 13 14 0 0 5 0

МНК Аутогенные МНК 4* 12+3* 11+3* 7* 25 5 5

аМСК Аутогенные МСК 3* 11+3* 12+3* 4* 25 5 5

аллоМСК Аллогенные МСК 4* 11+3* 12+3* 5* 25 5 5

Девит. клетки Девитализирован-нные МНК 3* 0 0 2* 25 5 5

Общее количество

животных на точку 14 56 58 18

Всего животных 146

Примечание: * - животные, которым вводили флуоресцентно-меченые клетки.

Выделение мононуклеарных клеток

Полученную костномозговую взвесь наслаивали на 3 мл раствора фиколла-урографина (плотность 1,077 г/мл) в стерильных 15 мл центрифужных пробирках. Пробирки центрифугировали при 1300 об/мин, 20 мин, 4 ?С. С помощью пипетки отбирали слой супернатанта непосредственно над слоем фиколла (интерфазное кольцо), в котором содержались мононуклеарные клетки и переносили в другую центрифужную пробирку со средой DMEM и снова центрифугировали 10 мин при 1100 об/мин и удаляли супернатант.

Выделение и наращивание мультипотентных стромальных клеток

Культура МСК была выделена и охарактеризована согласно стандартным протоколам Лаборатории стволовых клеток ЗАО «Реметэкс» [Ржанинова А.А. и др., 2003]. При экспансии МСК проводили не более четырех пассажей при низкой посевной плотности. Полученные клетки замораживали в криозащитном растворе, содержащем 10 % высокоочищенный диметилсульфоксид и 90 % аутологичной сыворотки. Криопробирки помещали в программный замораживатель, где они подвергались охлаждению до - 80оС со скоростью 1 о/мин. После этого криопробирки помещали в емкость для хранения (сосуд Дьюара) и хранили в жидкой фазе азота до использования.

Приготовление клеточного трансплантата

Полученные МНК или МСК ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора. На основании подсчета в камере Горяева полученное количество клеток разводили до концентрации 5 млн. кл./мл физиологического раствора. Жизнеспособность клеток определяли при окраске трипановым синим. В качестве трансплантата в контрольной группе использовали 1 мл физиологического раствора, жизнеспособность клеток в трансплантате составляла не менее 80%.

Приготовление трансплантата с девитализированными клетками

Полученные МНК ресуспендировали в 5 мл 4% раствора формалина на фосфатном буфере (pH=7,4) и инкубировали 30 мин при 4(С, после чего клетки отмывали от формалина многократным центрифугированием.

Витальное мечение клеток флуоресцентной меткой PKH26

Части животных вводили клетки, как живые, так и девитализированные, которые предварительно метили красной флуоресцентной мембранной меткой PKH26 (Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit, Sigma), согласно протоколу производителя.

Модель постинфарктного кардиосклероза

, 1960] с реперфузией. Животное наркотизировали смесью кетамин/ксилазин, внутримышечно в дозе 90-120 мг/кг + 10 мг/кг. Для обеспечения искусственной вентиляции легких проводили трахеальную интубацию и подсоединяли аппарат искусственной вентиляции легких (UGO BASILE, Rodent Ventilator).

Доступ к сердцу осуществляли по стандартной методике и накладывали лигатуру на левую коронарную артерию на 3 мм ниже ушка левого предсердия. При остром инфаркте на ЭКГ наблюдалось куполообразное поднятие сегмента ST, уменьшение зубца R или его замена комплексом QS. Также явным признаком развития окклюзии являлся цианоз передней стенки ЛЖ. После проведения 20 минутной окклюзии послойно ушивали операционную рану.

Интракоронарная трансвентрикулярная трансплантация

Клеточный трансплантат в опытных группах или физиологический раствор в контрольной вводили однократно через 30 суток после ОИМ в полость ЛЖ через катетер, введенный через наружную сонную артерию катетер, при кратковременном пережатии аорты ниже ее устья и места отхождения правой и левой коронарных артерий. Это обеспечивало во время сердечного выброса попадание трансплантата в коронарные кровеносные сосуды, а не в системный кровоток. Трансплантат вводили в полость ЛЖ в объеме 0,2 мл, после восстановления нормального давления в левом желудочке процедуру повторяли для введения всего объема трансплантата (1 мл, 5 млн. кл./мл).

Исследование функции сердца

Толерантность животных к физическим нагрузкам была изучена в тесте плавания перед трансплантацией и перед выведением животных из эксперимента.

ЭКГ регистрировали с помощью системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) при наложении электродов на правую переднюю лапу, грудь и правую заднюю лапу. С помощью программы “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) рассчитывали параметры сигнала ЭКГ.

Артериальное давление и давление в левом желудочке сердца определяли с помощью электроманометрических датчиков DTXTM Plus TNF-R, Becton Dickinson и системы мониторирования “HemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия). С помощью программы анализа сигналов давления “AnalyzeHemoDynamics” v.1.1. (ИБК РАН, Россия) были рассчитаны среднее артериальное давление, максимальное левожелудочковое давление и индексы контрактильности.

Морфологическое исследование

Выведение животных из эксперимента проводили в СО2-камере. При вскрытии исследовали полости тела и внутренних органов. Фиксировали органы, указанные в Табл. 2.

Таблица 2. Органы, исследованные различными морфологическими методами

Методы / Органы Сердце Печень Легкие Селезенка

Флуоресцентная микроскопия 50 50 50 50

Патоморфологическое исследование 96 96 96 96


загрузка...