Клубеньковые бактерии дикорастущих бобовых растений Южного Урала и молекулярное конструирование их искусственных ассоциаций с небобовыми растениями (16.01.2012)

Автор: Баймиев Андрей Ханифович

Astragalus danicus 10 1 Mesorhizobium sp. +

A. macropus 10 1 Mesorhizobium sp. +

A. cornutus 5 1 Mesorhizobium sp. +

A.wolgensis 10 1 Ensifer sp. +

A. helmii 10 1 Mesorhizobium sp. +

A. cicer 10+80 2 Mesorhizobium sp. 12%

Agrobacterium sp. 88% +

Oxytropis sordida 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. hippolyti 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. pilosa 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. floribunda 5 1 Mesorhizobium sp. +

O. spicata 4 1 Mesorhizobium sp. +

Galega orientalis >100 1 Rhizobium galegae +

Сравнение филогении генов 16S рРНК и nifH взятых в анализ клубеньковых бактерий в целом не выявил их различий. Исключение составили штаммы Phyllobacterium sp. из клубеньков Caragana arborescens, у которых ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами бактерий рода Mesorhizobium.

???????.

????hд(

!оказались однородны, а микросимбионты остальных растений имели разную степень гетерогенности. Первичный филогенетический анализ методом 16S ПДРФ выявил разделение штаммов Genista tinctoria на 5 монофилетических групп, а микросимбионтов Coronilla varia, Chamaecytisus ruthenicus и Hedysarum razoumowianum на 2 группы. Филогенетический анализ на основе сравнения генов 16S рРНК показал (рис. 8), что все исследуемые штаммы ризобий из клубеньков Lotus ucrainicus близки к бактериям Mesorhizobium ciceri, а обе монофилетические группы микросимбионтов родственного вида Coronilla varia к Rhizobium leguminosarum. Самую высокую разнородность показали клубеньковые бактерии из клубеньков Genista tinctoria, которые по последовательности генов 16S рРНК оказались близки Bradyrhizobium elkanii., Rhizobium sp. и Phyllobacterium sp. Микросимбионты Chamaecytisus ruthenicus оказались близки к Bradyrhizobium elkanii и Phyllobacterium sp., микросимбионты Onobrychis arenaria - Phyllobacterium trifolii (табл. 3).

Клубеньковые бактерии растений рода Hedysarum (Hedysarum grandiflorum и H. razoumowianum) совместно с микросимбионтами Oxytropis floribunda на филогенетическом древе образуют отдельную ветвь. По последовательности генов 16S рРНК данные бактерии похожи на недавно описанный вид Mesorhizobium alhagi, штаммы которого первоначально выявлены в клубеньках Alhagi sparsifolia (Chen et al., 2010). Минорный же штамм из клубенька H. razoumowianum, имеет родство с Bradyrhizobium elkanii.

Таблица 3

Состав и генетическая характеристика штаммов клубеньковых бактерий из клубеньков дикорастущих видов бобовых трибы Loteae, Genisteae и Hedysareae

Растение-хозяин Кол-во выделенных штаммов Количество групп штаммов, гомогенных по 16S-ПДРФ Предполагаемый вид бактерий и их процентное соотношение у одного и того же растения Наличие симбиоти-ческих генов

ТРИБА Loteae

Lotus ucrainicus 5 1 Mesorhizobium loti +

Coronilla varia 24 2 Rhizobium leguminosarum +

ТРИБА Genisteae

Genista tinctoria 18 5 Bradyrhizobium sp. 61%

Rhizobium sp. 22,3%

Phyllobacterium sp. 16,7% +

Chamaecytisus ruthenicus 5 2 Bradyrhizobium sp. 60%

Phyllobacterium sp. 40% +

ТРИБА Hedysareae

Hedysarum grandiflorum 5 1 Mesorhizobium sp. +

H. razoumowianum 4 2 Mesorhizobium sp. 75%

Bradyrhizobium sp. 25% +

Onobrychis arenaria > 100 1 Phyllobacterium trifolii

Исследования методом ПЦР выявили у всех взятых в анализ штаммов наличие симбиотических генов, за исключением Phyllobacterium sp. из клубеньков Genista tinctoria.

Сопоставление филогении рибосомного и симбиотических генов показало, что в основном для полученных микросимбионтов характерно их совпадение, кроме минорного штамма 11B, полученного из клубенька H. razoumowianum, который по последовательности гена 16S рРНК близок к Bradyrhizobium, но содержит ген nifH, имеющий гораздо большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium. Если учесть тот факт, что основными симбионтами у H. razoumowianum, по нашим данным, являются бактерии рода Mesorhizobium, то можно предположить, что штамм 11В, возможно, приобрел симбиотические гены данных бактерий посредством горизонтального переноса генов, что придало ему способность вступать в симбиоз с этим растением. У Phyllobacterium sp., выделенных из клубеньков Chamaecytisus ruthenicus, ген nifH имеют высокую гомологию с аналогичными генами Bradyrhizobium.

Делая обобщение, можно сказать, что состав исследованных микросимбионтов, взятых в анализ дикорастущих видов бобовых Южного Урала, оказался довольно разнообразным. Основное значение на таксономический состав микросимбионтов имеет вид растения-хозяина. Но в некоторых случаях прослеживается также влияние других факторов. В присутствии в клубеньках минорных видов ризобий у Caragana frutex и Genista tinctoria четко прослеживается зависимость от условий произрастания растения-хозяина. Так, например, у Caragana frutex, произрастающей в степной зоне и на южных склонах, в клубеньках были обнаружены бактерии Mesorhizobium sp. и Bradyrhizobium sp., а у растений, произрастающих в лесных и парковых зонах, где почва менее прогревается и более увлажнена - Mesorhizobium sp. и Rhizobium sp. Подобная картина наблюдается и у Genista tinctoria, у которой в прогреваемых почвах в клубеньках обнаруживаются только Bradyrhizobium sp., а в лесных зонах еще и Rhizobium sp. Данное явление, как мы предполагаем, связано с различной приспособленностью видов бактерий к разным почвенным условиям. Так, известно, что для большинства штаммов Rhizobium оптимальная температура наибольшей азотфиксирующей продуктивности в симбиозе с бобовыми растениями находится в пределах 24-26?С, а при повышении температуры > 30?С она резко снижается (Мишустин, Шильникова, 1973), что и является, скорее всего, причиной их отсутствия в клубеньках растений, произрастающих в прогреваемых сухих почвах.

Также в этом плане весьма интересны штаммы, относящиеся к Phyllobacterium sp. Данные бактерии, описанные впервые Knosel (1962), как бактерии, образующие клубенек-подобные структуры на листьях некоторых тропических растений, в клубеньках дикорастущих бобовых умеренного климата встречаются довольно часто (Mantelin et al., 2006; Valverde et al., 2005). Нами Phyllobacterium sp. были обнаружены в клубеньках всех взятых в анализ кустарниковых видов бобовых: Chamaecytisus ruthenicus, Caragana frutex, Caragana arborescens и Genista tinctoria, а также в клубеньках двух травянистых видов бобовых: Onobrychis arenaria и Lathyrus gmelinii. Но, тем не менее, симбиотические гены были обнаружены не у всех исследованных штаммов данного вида. Так, не удалось обнаружить sym-гены методом ПЦР с использованием стандартных праймеров у штаммов, полученных из клубеньков Genista tinctoria, Caragana frutex и Onobrychis arenaria, а обнаруженные у других штаммов данные гены имели разное происхождение. У штамма С2А (Chamaecytisus ruthenicus), ген nifH имеет высокую гомологию с аналогичными генами, описанными у штаммов Bradyrhizobium, у бактерий из клубеньков Lathyrus gmelinii nifH и nodA соответствовали таковым R. leguminosarum bv. viceae. В работах некоторых авторов также не были обнаружены симбиотические гены у Phyllobacterium выделенных из клубеньков (Bromfield, 2010; Lei et al., 2008). Роль данных бактерий в симбиотических взаимоотношениях ризобий с бобовыми растениями остается неясной и является предметом дальнейших исследований.

Надо сказать, что любые вновь появившиеся рекомбинанты проходят через селектирующий отбор, который преодолевает лишь очень небольшая их часть, поскольку не любая трансмиссия симбиотических генов приводит к появлению эффективных и конкурентоспособных штаммов клубеньковых бактерий. Необходимо образование удачной комбинации вновь приобретенных sym-генов и имеющегося генетического фона. И для появления подобной комбинации порой необходим большой промежуток времени. По крайней мере, как нами было выявлено, у интродуцированных на территорию Южного Урала бобовых растений Galega orientalis (интродуцирован в 80-е годы прошлого века) и Caragana arborescens (в культуре с 1752 года) за время их произрастания в новых условиях изменений в составе клубеньковых бактерий еще не произошло. Хотя, например, у аборигенного родственного вида Caragana frutex состав симбионтов весьма разнообразен.


загрузка...