Локальная и дистантная регуляция сократительной активности гладких мышц воздухоносных путей (15.08.2011)

Автор: Дьякова Елена Юрьевна

Исследуемые вещества (гистамин, сальбутамол, серотонин) реализуют свое действие через несколько известных путей: активация Ca2+-каналов, фосфоинозитидный путь, влияние на аденилатциклазу и пр. Однако в последнее время все большее внимание уделяется участию в сократительных реакциях мышечных клеток цитоскелета. Согласно данным литературы, цитокины также оказывают свое влияние через цитоскелет [Д.М. Фаллер, Д. Шилдс, 2004]. В связи с этим было проведено исследование различных сократительных реакций сегментов ВП в присутствии дезинтеграторов цитоскелета.

Для влияния на цитосклет были использованы неселективный дезинтегратор цитоскелета колхицин, селективные дезинтеграторы цитоскелета цитохалазин Д и нокодазол.

В первой серии экспериментов было исследовано влияние колхицина в концентрации 10 мкМ на гиперкаливое сокращение сегментов ВП животных контрольной группы. Полученные результаты пришлось разделить на две группы: половина исследуемых сегментов отвечала увеличением амплитуды сократительного ответа (рисунок 5) на 41,98 % (n=8, p<0,05), другая половина сегментов – уменьшением на 32,59 % (n=6, p<0,05).

Рисунок 5 – Влияние колхицина на величину гиперкалиевого сокращения сегментов воздухоносных путей животных контрольной группы

По оси ординат – механическое напряжение в процентах от амплитуды контрольного сокращения на гиперкалиевый раствор Кребса (МН, %).

* - достоверность различий в амплитудах сократительных реакций сегментов, предобработанных колхицином, и интактных (p(0,05).

При проведении аналогичных экспериментов на сегментах ВП сенсибилизированных животных были получены подобные результаты: после предобработки колхицином одна часть сегментов отвечала повышением амплитуды сократительного ответа на воздействие гиперкалиевого раствора на 49,08±1,7 % (n=8, p(0,05), другая часть – снижением на 20,64±1,2 % (n=6, p(0,05).

Полученные неоднозначные результаты исследования влияния колхицина на гиперкалиевое сокращение сегментов ВП могут быть связаны с тем, что неселективный дезинтегратор цитоскелета колхицин вызывает разрушение различных компонентов цитоскелета в неравнозначной степени. Для проверки выдвинутой гипотезы были проведены эксперименты с селективными дезинтеграторами цитоскелета цитохалазином Д (является дезинтегратором микрофиламентов, использовался в концентрации 1 мкМ) и нокодазолом (является дезинтегратором микротубул, концентрация, взятая для экспериментов – 10 мкМ).

После 45-минутной предобработки цитохалазином Д величина гиперкалиевого сокращения сегментов ВП достоверно уменьшилась (n=9, p<0,05), после 60-минутной предобработки нокодазолом, амплитуда сократительного ответа достоверно увеличилась (n=6, p<0,05). Эти данные явились подтверждением выдвинутой гипотезы. Известно, что деполимеризация микротрубочек в артериолах обусловливает вазоконстрикцию артериол, не связанную с повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция и не зависимую от эндотелия. Было предложено, что микротрубочки могут участвовать в кальциевой сенситизации сосудистых ГМК, при развитии сократительного ответа [R.J. Paul, P.S. Bowman, M.S. Kolodney, 2000]. Кроме того, было продемонстрировано, что деполимеризация микротрубочек может вести к повышению активности ряда сигнальных протеинов, причем в регуляцию этого процесса вовлекается RhoA/ROCK-зависимый сигнальный путь [K. Chitaley, R.C. Webb, 2001; H. Shimokawa et al., 2002]. Таким образом, микротубулы также могут быть вовлечены в релаксирующие реакции гладких мышц ВП. Известно, что с микротрубочками ассоциирован белок высокой молекулярной массы БАМ-2, способный связываться с цАМФ-зависимой протеинкиназой, стимуляция которой приводит к реализации расслабления.

Предобработка сегментов цитохалазином Д, наоборот, приводит к достоверному снижению гиперкалиевого сокращения ВП. Похожие результаты были получены на изолированных артериальных ГМК: обработка артерии цитохалазином Д и латрункулином, ингибиторами полимеризации актиновых филаментов, вела к уменьшению контрактильных реакций, не влияя на концентрацию ионов кальция [L. Shaw et al., 2003]. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о вовлечении актиновых филаментов в сократительные реакции.

В следующей серии экспериментов было исследовано влияние колхицина на сократительные реакции сегментов ВП, вызванные воздействием гистамина. Данное вещество было выбрано как фактор, вызывающий наиболее сильные сократительные ответы по предыдущим данным.

Величина сократительного ответа на действие БАВ без предобработки колхицином принималась за 100 %. После предобработки колхицином амплитуда сократительного ответа сегментов ВП животных контрольной группы на воздействие гистамина в концентрации 100 мкМ снижалась на 53,3±4,5 %; (n=9, p<0,05).

Следующим этапом было исследование участия цитоскелета в сократительных реакциях сегментов ВП сенсибилизированных животных, развивающихся в ответ на добавление гистамина в концентрации 0,1 мМ.

Величина сократительного ответа на действие БАВ без предобработки колхицином принималась за 100 %. После предобработки колхицином амплитуда сократительного ответа сегментов ВП на воздействие гистамина снижалась на 21,5±4,7 %; (n=6, p<0,05).

Таким образом, использование колхицина при исследовании рецептор-зависимых сократительных реакций дает однонаправленные эффекты: снижение величины амплитуды гистаминергических реакций сегментов ВП животных, как контрольной группы, так и экспериментальной. Уменьшение сократительных реакций на воздействие гистамина, вероятно, можно объяснить тем, что данный тип сократительной активности реализуется через фосфоинозитидный путь, а оперирование данного сигнального пути связанно с цитоскелетом, следовательно, дезинтеграция цитоскелета может приводить к снижению сократительной активности ГМ сегментов ВП. Исходя из предыдущих результатов, можно сделать предположение о том, что в оперировании фосфоинозитидного пути принимают участие актиновые филаменты цитоскелета.

При формировании гиперреактивности эффект воздействия колхицина на сократительные реакции снижается. Наблюдается уменьшение гистаминергических реакций, однако это снижение почти в два раза слабее, чем у сегментов ВП животных контрольной группы. Эти результаты могут служить косвенным доказательством того, что при сенсибилизации происходит изменение в структуре цитоскелета, поэтому дополнительная дезинтеграция компонентов цитоскелета оказывает незначительное действие. Белки цитоскелета, как и любые белки клетки, закодированы в ДНК и синтезируются на рибосомах. Установлено, что ИЛ-5 может оказывать стимулирующий эффект на экспрессию мРНК bcl-2 [Л.М. Огородова и др., 2006]. Возможно, что при сенсибилизации ИЛ-5, эффекты которого обсуждались ранее, также способствует увеличенному синтезу белков актина цитоскелета, что в конечном итоге ведет к увеличению сократительных реакций и снижению дилатационных.

6 Механизмы влияния взвеси нанодисперсных структур на сократительные реакции гладких мышц воздухоносных путей морских свинок

Эффекты, схожие с влиянием колхицина на гиперкалиевое сокращение, были получены также при исследовании воздействия нанодисперсных структур на сократительную активность ВП. Наноматериалы в настоящее время широко используются в промышленности, все чаще их стали применять для производства предметов повседневного потребления. Для частиц более крупных размеров порядка микрометров в организме человека и животных существуют системы элиминации (например, макрофаги, секрет, выделяющийся слизистой и пр.). Наноструктуры, обладая ничтожными размерами, могут быть сравнимы с частями клетки, органоидами, и остается открытым вопрос, какое действие могут оказывать наноматериалы на организм человека. Одним из наиболее вероятных путей попадания наноструктур в организм человека является трахеобронхиальное древо. Поэтому в данной работе проводилось исследование влияние взвеси нанодисперсных структур CoFe2O4 in vivo (ингаляционное воздействие) и iv vitro (непосредственное добавление нанопорошка в камеру с изолированными сегментами) на сократительную активность ГМ ВП. CoFe2O4 является соединением, не вступающим ни в какие химические реакции в организме. Исследования, проведенные Московским институтом биологии безопасности на культуре клеток, показали, что данное вещество не обладает токсичностью [О.Г. Терехова и др., 2008]. Следовательно, его эффект обусловлен именно нанометровыми размерами.

Первым этапом было определение оптимальной концентрации наночастиц в аэрозоле, которым предполагалось ингалировать экспериментальных животных. Для этого на базе «НИИ Оптики атмосферы» были проведены исследования пропускания лазерного излучения через аэрозоль в зависимости от концентрации нанодисперсных частиц CoFe2O4 в растворе. Проводили измерение коэффициента пропускания лазерного излучения через аэрозоли нанопорошков, полученных из растворов разной концентрации. В результате было получено, что максимальное изменение пропускания лазерного излучения аэрозоля из раствора происходило при концентрации нанопорошка в растворе 0,05 мг/мл. Другие же концентрации нанопорошка в растворе оптически не отличались от концентрации аэрозоля чистого растворителя. В связи с этим для ингаляции животных наноматериалом была выбрана концентрация 0,05 мг/мл.

Животных экспериментальной группы подвергали ингаляции нанопорошком, а затем проводили опыты на изолированных кольцевых сегментах ВП вышеописанным способом.

Все исследуемые сегменты отвечали сокращением на воздействие гистамина в концентрациях 0,1 нМ – 100 мкМ, максимальная амплитуда сокращения составила 97,2(5,3% (n=13). При этом на концентрации гистамина 0,1 – 100 мкМ, амплитуда сокращения сегментов экспериментальной группы была достоверно выше (p(0,05) амплитуды сокращения сегментов бронхов животных контрольной группы.

В следующей серии экспериментов было исследовано влияние сальбутамола на деэпителизированные сегменты ингалированных аэрозолем нанодисперсных частиц морских свинок, предсокращенных гистамином. Деэпителизированные сегменты отвечали дозозависимым расслаблением на воздействие сальбутамола в концентрациях 0,01 мкМ – 10 мкМ, максимальная величина расслабления достигала -79,14(2,06 % от амплитуды предсокращения (n=8). При сравнении изменения механического напряжения интактных сегментов ВП животных контрольной и экспериментальных групп было обнаружено, что в ряду концентраций сальбутамола 0,1 нМ – 10 мкМ амплитуда расслабления у сегментов ВП животных экспериментальной группы была достоверно больше (p(0,05 для всех случаев), чем у сегментов ВП морских свинок контрольной группы.

Но так как в организме существуют системы элиминации чужеродных агентов, то также были проведены эксперименты по воздействию нанодисперсных структур на изолированные гладкомышечные сегменты ВП.

Для изучения влияния взвеси нанодисперсных частиц в камеру, в которой находились сегменты, добавляли CoFe2O4 в концентрации 0,3мг/мл. Такая концентрация была определена эмпирически, увеличение концентрации нанопорошка не приводило к изменению результатов.

В первой серии экспериментов исследовали влияние нанопорошка CoFe2O4 на сокращение ГМ ВП морских свинок, вызванное гиперкалиевым раствором Кребса.

После предобработки CoFe2O4 в ответ на добавление гиперкалиевого раствора одна часть сегментов отвечала увеличением сократительного ответа, другая – уменьшением, поэтому полученные результаты были разделены на две группы. Одна часть сегментов отвечала увеличением амплитуды сокращения на 50,2±2,2 % (n=5, p<0,05), вторая – уменьшением на 22,2±1,4 % (n=6, p<0,05). Похожее разделение результатов было получено при исследовании влияния дезинтегратора цитоскелета. Вероятно, наноструктуры могут действовать на клетку через цитоскелет, нарушая процессы полимеризации – деполимеризации.

Для изучения влияния нанорошка CoFe2O4 на гистаминергическую регуляцию, он добавлялся в камеру (0,3мг/мл), в которой находились сегменты ВП морских свинок, после чего в камеру добавлялся гистамин в концентрации 0,01 – 100 мкМ. Все сегменты отвечали на воздействие гистамина дозозависимым сокращением. При этом величина сократительного ответа сегментов, обработанных нанопорошком, была достоверно выше на концентрации гистамина 0,1 – 100 мкМ (n=8, p<0,05) по сравнению с интактными сегментами.

Для изучения влияния нанорошка CoFe2O4 на адренергическую регуляцию, он добавлялся в камеру (0,3мг/мл), в которой находились сегменты ВП морских свинок, после чего сегменты предсокращались гистамином, затем в камеру добавлялся сальбутамол в концентрации 0,01 нМ – 100 мкМ. Все сегменты отвечали на воздействие сальбутамола дозозависимым расслаблением. При этом величина дилатационного ответа сегментов, обработанных наноматериалом, была достоверно ниже на концентрацию сальбутамола 1 нМ – 100 мкМ (n=10, p<0,05).

Таким образом, воздействие наночастиц in vivo и in vitro приводит к однонаправленным результатам: увеличиваются сократительные гистаминергические и дилатационные адренергические реакции. Не исключено, что нанодисперные частицы CoFe2O4 при ингаляционном введении вызывают неспецифическое воспаление. Нанопорошок может активировать иммунокомпетентные клетки, которые, в свою очередь, выделяя БАВ, такие как интерлейкины, простагландины, лейкотриены, влияют на сократительную активность ВП. Возможно, что наночастицы воздействуют на эпителий ВП, который в ответ на стимуляцию выделяет контрактильные и релаксирующие факторы. Также может происходить либо увеличение экспрессии рецепторов к гистамину и сальбутамолу, либо увеличение чувствительности этих рецепторов. Косвенным доказательством этому могут служить данные о том, что лабораторные животные испытывают респираторные проблемы при ингаляции углеродными нанотрубками [D.B. Warheit et al., 2004].

Скорее всего, все эти механизмы реализуются одновременно, приводя, в конечном итоге, к усилению реактивности ГМ ВП на различные раздражители.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, направленные на изучение изменений внутриклеточных механизмов при различных патологических состояниях остаются на сегодняшний день актуальными. Все конечные проявления патологий на организменном уровне берут свое начало с изменения функционирования структурной единицы всего живого – клетки. Проявлением на уровне организма такого состояния как бронхиальная астма является бронхоспазм, с выраженностью которого связывают степень тяжести заболевания. Применяемая в настоящее время терапия имеет много побочных эффектов, ухудшающих уровень жизни больных. Поэтому фундаментальные исследования изменения механизмов регуляции сократительной активности мышц трахео-бронхиального дерева остаются актуальными. Исследования регуляторных механизмов ГМК при бронхиальной астме могут лечь в основу принципиально нового, патогенетически обоснованного способа коррекции бронхоспастических состояний.

Перспективным путем выяснения упомянутых механизмов является моделирование дисфункции респираторного тракта у экспериментальных животных. В данном исследовании моделью дисфункции респираторного тракта явилась сенсибилизация морских свинок овальбумином.

В результате проведенных экспериментов были получены данные, уточняющие и расширяющие представления об изменении механизмов регуляции гладких мышц воздухоносных путей в условиях формирования гиперреактивности.

Было выяснено, что модулирующее влияние эпителия на адренергическую релаксацию гладких мышц в физиологических условиях (у экспериментальных животных контрольной группы) зависит от вида действующего на эпителий медиатора.

В случае, когда предсокращение гладких мышц осуществляется с помощью гистамина, то присутствие эпителия снижает амплитуду сократительного ответа. Вклад эпителия в реализацию адренергического расслабления гладких мышц бронхов при высоком гистаминергическим тонусе обусловлен, вероятно, совместной активацией адрено- и гистаминергических механизмов [Я.Д. Анфиногенова, 1997]. Сальбутамол вызывает цАМФ-зависимую релаксацию гладких мышц, на которую накладывается гистаминергическая стимуляция эпителия, выделяющего NO, усиливающий дилатационный ответ.

Если предсокращение проводится гиперкалиевым раствором Кребса, то эпителий, по всей видимости, выделяет констрикторные факторы. На роль выделяемых эпителием факторов констрикции претендуют простаноиды и пептидсодержащие лейкотриены С4 и Е4 [J.M. Ndukwu et al., 1994].

В условиях формирования гиперреактивности модулирующая роль эпителия нивелируется. Вероятно, это связано с тем, что при сенсибилизации морских свинок овальбумином происходит нарушение целостности эпителиального пласта, возникают необратимые органические изменения стенки воздухоносных путей, это ведет к дефициту секретирующей функции эпителия, либо к дисбалансу выделяющихся контрактильных и релаксирующих факторов.

Большинство исследователей считает, что фактором, выделяющимся эпителием и обеспечивающим бронхорелаксацию, является оксид азота. Проведенные эксперименты с применением доноров оксида азота – нитропруссида натрия и нитрозоглутатиона – показали различия в реакциях при формировании сенсибилизации. Релаксирующее влияние нитропруссида натрия при сенсибилизации усиливается, а нитрозоглутатиона – угнетается. Возможно, объяснение данного феномена лежит в природе доноров азота. Так как нитрозоглутатион является эндогенным соединением, то в организме существует система его метаболизации. Вероятно, что при сенсибилизации эта система более активна и нитрозогултатион более эффективно разрушается.

На роль контрактильных факторов, выделяемых эпителиальными клетками, претендуют простаноиды и лейкотриены. Опытные данные, полученные с использованием ингибиторов ключевых ферментов циклооксигеназного и липоксигеназного путей метаболизма арахидоновой кислоты, свидетельствуют о том, что простагландины, тромбоксаны и лейкотриены увеличивают сократительные гистаминергические и серотонинергические реакции. При сенсибилизации эффекты неоднозначны: лейкотриены также усиливают сократительные гистаминергические и серотонинергические реакции, а при действии простагландинов и тробоксанов гистаминергическиий сократительный ответ снижается, серотонинергический – повышается. Такой результат может быть объяснен исходным состоянием воздухоносных путей. У животных контрольной группы система метаболизма арахидоновой кислоты не активна, поэтому ее стимуляция гистамином приводит к увеличенному, по сравнению с экспериментальной группой, эффекту. У сенсибилизированных животных простагландины, возможно, действуют через цАМФ, снижая констрикторный эффект. В условиях гиперспастического состояния простагландины вовлекаются в сократительный ответ на стимуляцию серотонином. Возможно, что стимуляция гистамином приводит к большей наработке ПГ-Е2, а серотонином – ПГ-B2.


загрузка...