Лечение воспалительных заболеваний кишечника аллогенными мезенхимальными стромальными клетками (15.06.2010)

Автор: Князев Олег Владимирович

Тяжесть атаки болезни Крона вычислялась в баллах. Применялся индекс Best. В оригинальном варианте полученную сумму баллов интерпретируют следующим образом: легкая 150-220, умеренная 220-450, тяжелая более 450 баллов.

Тяжесть атаки на момент обследования оценивалась с учетом клинических данных (тяжесть диареи, боли в животе, общее самочувствие, похудание), а также лабораторных данных (степень анемизации).

Таблица 4

Распределение больных болезнью Крона в зависимости от распространенности поражения, характера течения заболевания и тяжести атаки

Распространенность, характер течения 4-я (n=15) 5-я (n=15) 6-я (n=6)

Распространенность

Колит 7/46,6 7/46,6 3/50

Илеоколит 1/7,4 8/53,4 2/33,3

Илеит 7/46,6 - 1/16,7

Тяжесть атаки

Легкая 4/36,4 5/33,5 -

Среднетяжелая 11/63,4 10/66,5 4/66,4

Тяжелая - - 2/33,6

Примечание. В числителе – абсолютное число больных, в знаменателе – процент

Для оценки гормонорезистентности и гормонозависимости ВЗК использовались методические рекомендации, подготовленные на основе Европейского консенсуса по диагностике и лечению болезни Крона и язвенного колита, принятого Европейской организацией Крона и колита в 2004 году с дополнениями 2009 года. Согласно этим рекомендациям определение гормонорезистентности подразумевает сохранение активной формы заболевания, несмотря на применение преднизолона в дозе до 0.75 мг/кг/сут в течение 4 недель. Гормонозависимость предполагает, что при снижении дозы ГКС ниже эквивалента преднизолона 10 мг/сут (или дозу будесонида ниже 3 мг/сут) в течение трех месяцев после начала приема ГКС происходит рецидив активности заболевания, а так же если у больных ВЗК происходит рецидив в течение трех месяцев после отмены кортикостероидов. Данное определение предполагает, чтобы общая продолжительность приема кортикостероидов не превышала трех месяцев до достижения ремиссии болезни [Болезнь Крона (диагностика и лечение). Методические рекомендации. – Санкт-Петербург, «Наука и техника», 2007, стр.10-14].

Методы исследования

Клиническое состояние больных оценивали по специально разработанной карте, включающей жалобы, данные анамнеза и объективного обследования. Для оценки клинической активности язвенного колита мы использовали индекс, предложенный D.Rachmilevitz в 1989 году, учитывающий частоту дефекаций и интенсивность болевого синдрома в течение предшествующей недели, ежедневную кровопотерю и общее самочувствие, повышение температуры, наличие и характер внекишечных проявлений, уровень гемоглобина и СОЭ. Тяжесть атаки болезни Крона вычислялась в баллах, как указывалось ранее, нами применялся индекс Best.

Всем больным проводили эндоскопическое исследование на видеосистеме фирмы Фуджинон EVE W-88A или ректороманоскопия (РРС) с посегментарной оценкой активности воспаления по шкале D.Rachmilevitz (1989). Поскольку в оригинальном индексе учет активности осуществлялся по состоянию прямой и/или сигмовидной кишки, в качестве количественной оценки нами был принят максимальный балл, соответствующий степени воспаления. Осуществлялась множественная лестничная биопсия из всех отделов толстой кишки или тонкой кишки. Получали по 6-10 фрагментов слизистой оболочки кишки. Исследования проводились в отделении эндоскопии (д.м.н. проф. П.Л. Щербаков, к.м.н. В.А. Рогозина).

Гистологическое исследование биоптатов проводили с помощью световой микроскопии с предварительным окрашиванием гематоксилином и эозином. Морфометрическое исследование выполнено 43 больным с помощью системы автоматического анализа видеоизображений «Cito-W», фирмы Dia-Morph. Стадии изменений морфологической картины СОТК оценивали по классификации, предложенной шкале, предложенной Гебс [Geboes K., Riddel R., Jensfelt B., et al., 2000] (рук. лаб. патоморфологии ЦНИИГ – д.м.н. С.Г. Хомерики). Для подтверждения связи процессов регенерации с восстановлением иммунного баланса в организме, маркерами которого являются иммуноцитокины, нами производилось определение содержания в экстракте слизистой оболочки кишки больных ЯК и БК ИЛ-1?, ?-ФНО, ИЛ-4, ИЛ-6 до трансплантации МСК и через 2 месяца после введения клеток. Исследование цитокинов проводилось иммуноферментным методом с использованием тест систем Diamed (Швейцария) (зав. лабораторией патофизиологии ЦНИИГ д.м.н. Трубицыной И.Е.).

Содержание IgA, IgG, IgM определяли методом радиальной иммунодиффузии (Mancini G. et al., 1965), иммуноферментным методом с использованием тест-систем «IMMCO Diagnostics» (США) и коммерческих наборов (Orgentec Diagnostics GmbH). Антитела к цитоплазме нейтрофилов (IgG –ВРI) методом непрямой иммунофлюоресценции [Kallenberg С.G.M., Mulder A.H.L., Tervaert J.W.C., 1992], используя реактивы фирмы «IMMCO Diagnostics» (США). Цитокины ИЛ-1?, ИЛ-4, ИЛ-10, ?-ФНО, ТФР 1?- исследовали иммуноферментным методом с использованием коммерческих наборов тест-систем ООО «Протеиновый контур» и «Цитокин» (Санкт-Петербург). Иммуноферментный анализ содержания онкомаркеров СА-242, СА-19-9 до и после трансплантации МСК проводили тест-системами концерна "Hoffmann La Roche" (рук. лаб. иммунологии ЦНИИГ – д.м.н., проф. Т.М. Царегородцева, ст.н.с. д.м.н. – Р.Б. Гудкова, к.м.н. Т.И. Серова, к.м.н. В.Э. Сагынбаева).

Оценку клинического состояния больных, инструментальные и лабораторные методы исследования осуществляли перед включением в исследование, через 2, 6, 12 и 24 месяца.

Методика получения МСК. Методика получения и размножения аутологических и аллогенных МСК в необходимом для системной пересадки количестве (150-200 млн клеток) опубликована [Цыб А.Ф., Коноплянников А.Г., Колесникова А.И., и др., 2004]. Метод разрешен Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития МЗиСР РФ Медицинскому радиологическому научному центру РАМН, г. Обнинск (лицензия ФС-2006/206). Перед внутривенным введением МСК делали посев из полученных выращиванием в культуре популяций клеток для контроля возможного бактериального загрязнения (его не было выявлено ни в одном случае).

Методика введения МСК. Культуру МСК, выращенную из костного мозга здорового донора того же пола, вводили капельно в/в. Для осуществления системной пересадки 150-200 млн аллогенных МСК, размноженных в культуре, клетки суспендировали в 200 мл стерильного физиологического раствора, содержащего гепарин в концентрации 50 ед/мл, и путем постановки капельницы вводились пациенту в течение 40-60 минут.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием компьютерной программы «STATISTICA 6.0». Обработка полученных результатов с применением статистики малых выборок. Для определения значимости различий между средними величинами применяли t-критерий Стъюдента. Различия считали значимыми при уровне вероятности р<0,05. При оценке данных, не отвечающих нормальному распределению, использовали непараметрические методы: корреляционный анализ с применением коэффициента ранговой корреляции Спирмена (Rs); для анализа качественных признаков, применяли непараметрический критерий - ?2 . При количестве наблюдений менее 5 использовали поправку Йейтса; для сравнения двух выборок разного объема использовали ранговый критерий Манна-Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Прежде чем приступить к ограниченным клиническим испытаниям метода системной трансплантации аллогенных мезенхимальных стромальных клеток (МСК) костного мозга человека у больных с язвенным колитом и болезнью Крона, ЦНИИ гастроэнтерологии Департамента здравоохранения г. Москвы совместно с ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН г. Обнинска был проведен эксперимент по изучению терапевтического потенциала трансплантированных МСК при остром и хроническом поражении кишечника, индуцированном натрий декстран-сульфатом (ДС) у крыс линии Вистар.

Экспериментальный раздел работы выполнен на 60 лабораторных животных: крысах-самцах Вистар массой 250-300г, которых содержали в виварии ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН при свободном доступе к пище, на рационе питания, соответствующем нормативам ГОСТа.

Экспериментальный раздел состоит из 3-х основных частей. В 1 части работы проводилась отработка методов моделирования острого и хронического колита. Во 2 части работы была отработана методика введения МСК крысам с моделями острого и хронического колита и характеристика фенотипических свойств культуры клеток, подготовленных и использованных для трансплантации. В 3 разделе работы производили изучение деструктивных изменений слизистой оболочки кишки и процессов репаративной регенерации этих язв с помощью МСК. Третий раздел работы осуществлялся в лаборатории патоморфологии ЦНИИГ.

В ходе экспериментальной части работы было выявлено, что наиболее выраженные изменения при острой затравке дестран-сульфатом наблюдались в слизистой оболочке подвздошной кишки: отмечалось резкое уменьшение высоты кишечных ворсин, в ряде случаев кишечные ворсины вовсе отсутствовали, глубина крипт резко увеличивалась, наблюдалось увеличение количества межэпителиальных лимфоцитов и усиление лимфоплазмоцитарной инфильтрации собственной пластинки. Менее всего по сравнению с контрольной группой изменения были выражены в слепой кишке и восходящем отделе толстой кишки. Введение МСК в серии с острой затравкой существенно улучшало гистологическую картину слизистой подвздошной кишки: высота кишечных ворсин хотя и была в ряде случаев снижена, однако в целом соответствовала их состоянию в контрольной группе. В серии опыта с хронической затравкой декстран-сульфатом, по сравнению с острой, через 2 месяца после введения МСК гистологическая картина значительно улучшилась. Практически восстанавливалась нормальная структура слизистой оболочки подвздошной, слепой и восходящей кишки, значительно большая высота крипт по сравнению с контрольной группой. Введение МСК резко активизировало пролиферативные процессы и приводило к гиперплазии эпителия слепой кишки и усиливало образование мелких и крупных фолликулов как в слизистой оболочке, так и в подслизистом слое, увеличивалось количество бокаловидных клеток в эпителии, а также высота и число кишечных ворсин слизистой оболочки

Таким образом, было продемонстрировано, что МСК обладают высокой пролиферативной активностью и большим репаративным потенциалом. Введение МСК приводило к полному восстановлению и уменьшению воспаления слизистой оболочки слепой и восходящей кишки. Наиболее выраженные репаративные процессы отмечаются в серии опыта с хронической затравкой через 2 месяца после введения МСК.

Оценка эффективности различных методов лечения язвенного колита.

В настоящее время отсутствуют эффективные методы этиотропной терапии язвенного колита, а быстрое прогрессирование заболевания и большие затраты, связанные с лечением и трудопотерями убеждают в том, что для решения проблемы необходимо искать новые подходы, основанные на системном и комплексном исследовании данной патологии [Халиф И.Л., Лоранская И.Д., 2004; Hanauer S.B., 2005, Gibson P.R., Fixa B., Pekarkova B. et al., 2006, Sandborn W.J. et al., 2007]. Препараты 5-АСК являются базисными для лечения ВЗК с небольшой активностью и средней тяжести, как в стадии обострения, так и для профилактики рецидивов. ГКС применяют для лечения всех форм БК в случае отсутствия эффекта от применения 5-АСК, тяжелых форм ЯК и всех его форм при наличии внекишечных осложнений. В настоящее время перспективы эффективного лечения ВЗК связываются с синтезом фармакологических средств, обладающих антицитокиновым действием [Tilg H., van Montfrans С., van den Ende A., et. al., 2002]. Первые препараты данной группы (инфликсимаб, адалимумаб и др.) показали, что они позволяет достигнуть ремиссии в более короткие сроки, по сравнению с традиционными противовоспалительными препаратами, и обеспечить длительное и стойкое поддержание ремиссии ВЗК [Daniel H., Am J., 2001]. Но у 15–25% пациентов наблюдается рефрактерность и к глюкокортикоидам, и к селективным иммунодепрессантам, или возникают осложнения, связанные с длительным приемом препаратов.

Трансплантация мезенхимальных стромальных клеток при лечении тяжелых, рефрактерных форм воспалительных заболеваний кишечника в настоящее время не является стандартной терапией и требует дальнейшего проведения клинических исследований, однако уже сейчас эффективность данного метода убеждает в необходимости расширения дальнейших исследований.

Нами выбран наиболее адекватный способ введения культуры клеток, а так же методы оценки эффективности клеточной терапии: индекс клинической и эндоскопической активности ЯК, индекс Гебса, продолжительность ремиссии у больных с хроническим рецидивирующим и хроническим непрерывным течением язвенного колита (не менее 12 месяцев), оценка относительного и абсолютного рисков развития рецидивов заболевания, частоту госпитализаций в течение года. По результатам клинических, эндоскопических и морфологических исследований слизистой оболочки толстой кишки нами был проведен сравнительный анализ эффективности различных схем лечения больных язвенным колитом, включающих комплексную терапию с применением трансплантации МСК (1-я группа), терапию препаратами 5-АСК/ГКС (2-я группа), инфликсимабом (3-я группа) через 2, 6, 12 и 24 месяца от начала терапии. Больные всех трех групп были рандомизированы по возрасту, полу, индексам клинической, эндоскопической активности, длительности течения язвенного колита, протяженности поражения и средней продолжительности приема иммуносупрессоров. Данные показатели представляются важными для оценки прогнозирования эффективности клеточной терапии.

Трансплантация аллогенных МСК костного мозга была осуществлена 86 больным, что составило 10,8% от всех больных ВЗК, пролеченных в отделении патологии кишечника за 2 года. 59 больных включены в аналитическую группу, с минимальным сроком наблюдения 12 месяцев. Время наблюдения за больными составило от 12 до 24 месяцев.

Все больные ЯК получали по показаниям препараты 5-АСК (сульфасалазин, месалазин), кортикостероиды (метипред, преднизолон), иммунодепрессанты (азатиоприн). Больным первой группы за 2 – 3 дня до введения МСК отменяли иммунодепрессанты, снижали дозу кортикостероидов до 20 – 30 мг/сут, дозу аминосалицилатов оставляли на уровне 3,0 г/сут. У 12 больных после введения МСК наблюдалась слабая трансфузионная реакция. Она характеризовалась появлением субфебрильной температуры, артралгии и миалгии, продолжавшейся несколько часов. У двух больных развилась аллергическая реакция по типу крапивницы и отека Квинке, которую купировали введением антигистаминных препаратов и глюкортикостероидов.

Исходный уровень показателя клинической активности до начала терапии составил в 1- й группе 8,3±0,26 баллов, во 2-й - 8,1±0,2, а в 3-й, соответственно, - 8,5±0,5 разницы по группам по исходному индексу клинической активности не было (p>0,05). Наиболее полную информацию об активности, протяженности и патологических изменениях кишки при ЯК дают эндоскопические методы исследования. Уровень показателя эндоскопической активности до начала терапии составил в 1- й группе 7,7±0,3 баллов, во 2-й - 7,2±0,4, а в 3-й - 8,2±0,4. Разницы между 1-й и 2-й групп по исходному индексу эндоскопической активности не было (p>0,05), эндоскопическая активность была несколько выше в 3-й группе, так как терапию инфликсимабом получали больные с более тяжелым течением язвенного колита. Уровень основных исходных показателей группы больных с язвенным колитом в зависимости от метода выбранной терапии представлен в таблице 5.

Таблица 5

Сравнение групп по основным клиническим и демографическим показателям

Показатель Группа МСК (n=44) Группа


загрузка...