Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе (15.06.2009)

Автор: Сахаров Андрей Валентинович

Определить морфологические критерии выбора оптимального пассажа первичной культуры клеток, выделенных из фетальной хрящевой ткани зоны роста тела позвонка для создания тканеинженерных конструкций.

Изучить возможность ксенотрансплантации клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в условиях хирургического повреждения хрящевой ткани у лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые выявлены общие закономерности развития пластинки роста у человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза. Впервые получены новые сведения о возрастных особенностях развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, связанные с неравномерной пролиферацией и дифференцировкой клеток, а также пространственно-упорядоченной организацией межклеточного вещества в переднем и заднем отделах пластинки роста у человека, а у свиньи – в её вентральном и дорсальном отделах. Впервые установлены периоды неравномерного развития зоны роста тела позвонка, которые морфологически определяются у человека с 12 недель пренатального развития до 12 лет, а у свиньи – в период с 6 до 12 недель гестации. Впервые определены морфологические критерии выбора фетального гиалинового хряща зоны роста тела позвонка человека и свиньи для использования в качестве источника клеточного материала в тканевой инженерии. Впервые исследованы морфофункциональные характеристики фетальных клеток хондрогенного дифферона in vitro, которые могут быть использованы для оценки клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций. Впервые предложена концепция отбора клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций. В эксперименте на лабораторных животных впервые осуществлена ксенотрансплантация фетальных хондробластов человека для замещения дефекта гиалинового хряща.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Выявленные возрастные закономерности структурно-функциональной организации зоны роста тела позвонка человека и свиньи отражают сходство морфогенетических процессов у этих видов млекопитающих и могут быть использованы для уточнения границ критических периодов развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи. Установленная неравномерность пролиферации и дифференцировки клеток хондрогенного дифферона в переднем и заднем отделах пластинки роста тела позвонка человека, а у свиньи – в её дорсальном и вентральном отделах, обусловливает асимметрию роста тела позвонка, что может рассматриваться в качестве одного из патогенетических факторов развития деформаций позвоночника.

Выявленные особенности морфофункциональной организации клеток и матрикса гиалинового хряща зон роста позволяют определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани человека и свиньи в качестве источника клеточного материала для тканеинженерных конструкций. Определены морфологические критерии оценки и выбора клеточного материала для трансплантации в реконструктивной хирургии.

Предложенная экспериментальная модель дифференцировки хондробластов пластинки роста человека in vitro обеспечивает возможность прямого подхода к изучению изменений пластинки роста человека и животных, а также может быть использована для оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств на клетки хондрогенного дифферона in vitro.

Результаты данного исследования используются в учебном процессе при преподавании дисциплины «Гистология и эмбриология» в Новосибирском государственном медицинском университете, при изучении курса дисциплин «Анатомия» в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарёва и «Биология свиньи» в Биолого-технологическом институте Новосибирского государственного аграрного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

В развитии позвоночного столба человека и свиньи наблюдаются структурно-временные параллели.

Асимметрия роста и развития хрящевых пластинок роста тел позвонков грудного отдела человека и свиньи в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза является возрастной особенностью.

Фетальные хондробласты человека и свиньи, выделенные из гиалиновой хрящевой ткани зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации являются оптимальным источником клеточного материала для разработки тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Международном симпозиуме (Чолпон-Ата, 2003), III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), VIII съезде травматологов-ортопедов России (Самара, 2006), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007), Международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК на 2008-2012 гг.»» (Оренбург, 2008), Международной научно-практической конференции «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях» (Волгоград, 2009), IX Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 12 – в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.

Работа выполнена в Новосибирском государственном педагогическом университете (НГПУ) в рамках научно-технического сотрудничества и при участии сотрудников ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») – отдел микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов, НИИ инновационных медицинских технологий Новосибирского государственного медицинского университета (НГМУ), Научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (НИИТО), Биолого-технологического института Новосибирского государственного аграрного университета (НГАУ). Автор приносит искреннюю благодарность коллегам из указанных учреждений.

Особую признательность за консультативную помощь автор выражает директору НИИТО д-ру мед. наук, проф. М.А. Садовому и заведующей теоретическим отделом вертебральной патологии НИИТО д-ру мед. наук, проф. А.М. Зайдман, которые привлекли его внимание к проблеме нарушений структурно-функциональной организации пластики роста тела позвонка, а также предоставили возможность проведения исследований структурных компонентов тела позвонка человека в норме и при патологии. Автор признателен директору НИИ инновационных медицинских технологий, канд. мед. наук В.А. Валеевой, директору Биолого-технологического института НГАУ д-ру биол. наук, проф. К.В. Жучаеву, директору Института химии антиоксидантов НГПУ канд. хим. наук, проф. А.Е. Просенко и ректору НГПУ д-ру биол. наук, проф. А.Д. Герасеву за техническую и организационную поддержку на всех этапах выполнения диссертационного исследования. Искренне признателен, за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту – д-ру биол. наук, проф. Е.И. Рябчиковой.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического списка цитируемой литературы, который включает 406 источников, из них 101 отечественных и 305 – зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 160 рисунками и 11 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИСЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили тела грудных позвонков свиньи и образцы зон роста тел позвонков грудного отдела человека, которые получали из абортивного материала, а также от погибших людей, не имевших признаков патологии опорно-двигательного аппарата. Хондробласты выделяли из абортивного материала, полученного из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан, в соответствии с современными этическими нормами и с подписанием Информированного согласия. Характеристика материала приведена в таблице 1.

Таблица 1. Характеристика исследуемого материала

п/п Объект

исследования Возрастной

период Кол-во образцов

1 Первичная культура

фетальных клеток человека 12 недель 100

2 Зона роста тела позвонка эмбриона человека 8 недель 45

3 Зона роста тела позвонка плода человека 12 недель 57

4 Пластинка роста тела позвонка человека Новорожден-

ный -14 лет 187

Всего 389

5 Зона роста тела позвонка предплода свиньи 4 недели 60

6 Зона роста тела позвонка плода свиньи 6 -12 недель 367

7 Пластинка роста тела позвонка свиньи Новорожден-

ный - 40 суток 259

Всего 686

Фрагменты тел позвонков грудного отдела эмбрионов, а также плодов человека и свиньи породы Сибирская мясная (СМ-1) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и в 4%-ном растворе параформа, приготовленного на растворе Хенкса. Позвонки плодов декальцинировали в забуференном растворе ЭДТА. Материал обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм и монтировали на предметные стекла.

Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Коллаген выявляли по Маллори в модификации Б. Ромейса (1954). Локализацию кальция в клетках выявляли по Коссу (Пирс Э., 1962). Гликоген и гликопротеины определяли в реакции с реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Реакцию на суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) ставили с альциановым синим по С. Стидмену. Локализацию кератансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС), гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе, а также их пространственно-упорядоченную организацию в межклеточном веществе хрящевой ткани пластинки роста (ПР) изучали в реакции с толуидиновым синим при рН 1,5; 2,5 и 5,0. Пространственную организацию коллагена в межклеточном веществе определяли по Эбнеру и в реакции с пикросириусом красным (Дедух Н.В. 1988). Интенсивность рефракции оценивали на срезах в поляризованном свете. Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ, отдела микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ГНЦ ВБ «Вектор», кафедры свиноводства НГАУ.

Экспрессию белков генов р-53 и Bcl-2 определяли методом иммуногистохимического анализа в реакции с вторичными антителами. Индекс апоптоза рассчитывали по отношению числа клеток в состоянии апоптоза к общему количеству клеток в препарате и выражали в процентах (Аrcher C.D., 1998).

Интенсивность реакции на активированные кислородные метаболиты (АКМ) в образцах нативной хрящевой ткани ПР тел позвонков новорожденных поросят, а также поросят в возрасте 7 - 40-а суток оценивали в реакции с нитротеразолиевым синим (Hill K.S., 1978). Дифференциальное определение свободнорадикального оксида азота в хрящевой ткани ПР оценивали по локализации его селективного маркера – фермента NO-синтазы (Mayer B., 1995).

Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ и кафедры свиноводства НГАУ.

Для получения первичной культуры клеток использовали хрящевые тела позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации непосредственно после медицинского аборта от клинически здоровых женщин. Полученную первичную культуру клеток культивировали в концентрации 3х105 кл/мл в среде ДМЕМ/F12 (1:1) с добавлением 20% фетальной сыворотки крови плодов коровы при 370С в течение 4 пассажей на протяжении 12 дней. Каждые 3 дня клетки снимали с подложки смесью трипсина с версеном, четыре равные части центрифугата отбирали для проведения исследований, оставшиеся клетки пересевали. Исследования проводили на базе НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ, лаборатории морфологии НГПУ.


загрузка...