Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности её использования в селекции и семеноводстве (15.03.2010)

Автор: Леонова Нина Семёновна

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рис. 10. Изоферментный спектр алкогольдегидрогеназы в интактных растениях и каллусах картофеля. 1, 2, 3 - спектр каллусов сорта Приекульский, выращенных на среде с добавлением ауксина 2,4Д; 4, 5, 6 - спектр каллусов сорта Приекульский, выращенных на среде с добавлением ауксина НУК (не экспрессируется); 7, 8 - спектр интактных асептических растений сорта Приекульский (не экспрессируется); 9 - Спектр каллуса сорта Невский, выращенного на среде с добавлением ауксина 2,4Д; 10 - спектр каллуса сорта Невский, выращенного на среде с добавлением ауксина НУК (не экспрессируется); 11 - Спектр интактного асептического растения сорта Невский (не экспрессируется).

Такой простой тип спектра, содержащий один изофермент, характерен для ферментов, находящихся под контролем одного гена. Однако следует заметить, что среди изученных ферментов растений почти нет таких, которые контролировались бы одним геном. Можно выявить лишь определенные стадии онтогенеза, в которых активен лишь один локус. Если растение гомозиготно по такому локусу, то на электрофореграмме выявляется в основном один изофермент. Это показано для многих ферментов, например, для алкогольдегидрогеназы в покоящихся семенах кукурузы (Левитес и др., 1974). Такой стадией в культуре in vitro, вероятно, и является каллусная культура, растущая на среде с 2,4Д. Следует отметить, что АДГ является ферментом, активным в тканях, которые не используют атмосферный кислород. В таких тканях использование глюкозы идет очень неэффективно. Но как только растение выходит из анаэробных условий и начинает использовать кислород атмосферы, АДГ ингибируется, и процессы усвоения и использования глюкозы идут эффективно, с активным включением ферментов цикла Кребса (Гринева, 1975). Экспрессия АДГ у каллусной культуры, выращенной на средах, содержащих ауксин 2,4Д, свидетельствует о низкой эффективности потребления глюкозы в клетках этой культуры, находящейся в данных условиях. У каллусов, выращенных на средах с другими ауксинами, на морфогенных средах, т.е. средах с добавлением цитокининов, и у интактных растений алкогольдегидрогеназа не экспрессируется, что говорит о более высокой эффективности использования глюкозы в обменных процессах.

Представляет интерес сравнение активности АДГ в каллусах с интенсивностью их роста, который не может не зависеть от эффективности обменных процессов. Как было показано выше, каллусы на среде с 2,4Д растут значительно медленнее, чем на среде с ауксином НУК (Рис. 11). Это является хорошим доказательством более высокой эффективности обменных процессов в каллусах, растущих на средах, не содержащих 2,4Д.

1 2 3 4

Рис. 11. Влияние ауксинов на рост каллусной культуры. 1- Каллусная культура сорта Приекульский на среде с НУК 10 мг/л; 2 - Каллусная культура сорта Приекульский на среде с 2,4Д 2 мг/л; 3 - Каллусная культура М-987 на среде с НУК 10 мг/л; 4 - Каллусная культура М-987 на среде с 2.4Д 2мг/л.

Характерно, что на средах с добавлением ауксина НУК и ИУК в каллусах синтезируется белка меньше, чем на средах с 2.4Д, но каллусная культура растет быстрее и каллус более рыхлой консистенции на средах с НУК. Хотя морфогенных зон больше на каллусах, выращенных на средах с 2.4Д .

Глутаматдегидрогеназа (ГДГ) разных видов растений контролируется разным числом локусов, отличающихся своей экспрессией. ГДГ по своей четвертичной структуре – гексамер. У кукурузы ГДГ контролируется двумя локусами (Goodman, Stuber, 1983). У ряда видов, таких как рожь (Jaaska, 1972), сосна (Adams, 1980) и ячмень (Endo, 1983) выявлена одна зона активности ГДГ.

Рис.12. Изоферментные спектры глутаматдегидрогеназы в интактных растениях и каллусах картофеля. 1-4 – каллус сорта Темп на средах с 2,4Д; 5 и 7 – интактное растение сорта Темп; 8-11 – каллус сорта Вигри на среде с 2,4Д; 12 и 13 – интактное растение сорта Вигри;

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

14,16-19 - каллус сорта Адретта на среде с НУК; 20 – каллус сорта Адретта на среде 2,4Д+НУК; 6 и 15 – семена сахарной свеклы, взятые в качестве стандарта.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рис. 13. Изоферментные спектры глутаматдегидрогеназы в интактных растениях и каллусах картофеля. 1-4 – каллус сорта Адретта на средах с 2,4Д+НУК; 5 и 7 – интактное растение сорта Адретта; 8-11 – каллус сорта Берлихенген на среде с НУК; 12 и 13 – интактное растение сорта Берлихенген; 14,16-18 – каллус сорта Bentjae на среде с 2,4Д; 19 и 20 – интактное растение сорта Bentjae; 6 и 15 – семена сахарной свеклы, взятые в качестве стандарта.

В наших исследованиях ГДГ картофеля представлена на электрофореграмме двумя анодными зонами: быстромигрирующей и медленномигрирующей. В растениях чаще всего выявляются обе зоны, а в каллусах - только медленно мигрирующая. Интактные растения картофеля различаются по характеру проявления ГДГ быстрой зоны. Так, например, у сорта Берлихенген ГДГ в быстрой зоне не выявляется, тогда как у трех других сортов ГДГ в этой зоне активна. Присутствие в среде НУК снижает активность ГДГ в каллусах. Так, при наличии в среде 2,4Д+НУК активность ГДГ всех зон снижена по сравнению с той, которая наблюдается в каллусах, выращенных на среде, содержащей 2,4Д. Если же в среде нет 2,4Д, а присутствует НУК, то активность ГДГ следовая (рис. 10)

Малатдегидрогеназа (МДГ) исследована у многих видов растений. У разных видов растений изоферментный спектр состоит не менее, чем из двух зон, что соответствует наличию множественных форм фермента, имеющих различную субклеточную локализацию (цитоплазматическую, митохондриальную и микросомальную). Известно, что по первичной структуре цитоплазматические и митохондриальные формы различаются между собой гораздо сильнее, чем митохондриальные формы МДГ разных родов (Newton, 1982). Изоферментные спектры МДГ картофеля представлены тремя зонами, из которых одна наиболее быстрая четко отделена от второй (средней) и третьей (медленной) зон. Вторая и третья зоны расположены близко друг к другу. Изоферментные спектры в этих зонах независимы; это позволяет предположить, что данные зоны контролируются неаллельными генами. Обнаружены также ярко выраженные различия между каллусами и интактными растениями в относительной активности и числе изоферментов, что свидетельствуют о различии в экспрессии генов, контролирующих МДГ. Выявляемая на электрофореграммах активность МДГ в каллусах, выращенных на среде с 2,4Д, намного выше, чем в каллусах, выращенных на среде с НУК.

Таким образом, влияние фитогормона 2,4Д на экспрессию МДГ в культуре in vitro аналогично тому, которое наблюдалась и у АДГ.

В каллусах, выращенных на средах с ауксинами и перепассированных на среды для морфогенеза, содержащие цитокинин зеатин и уменьшенное содержание ауксинов, после месячного культивирования изоферменты ГДГ, МДГ и АДГ не экспрессируются.

У регенерантов электрофоретический спектр белка и изоферментов, восстанавливается и в основном идентичен спектрам исходных растений данного сорта, иногда с изменениями в интенсивности того или другого компонента и реже с появлением или исчезновением некоторых компонентов.

Электрофоретический спектр общего белка и изоферментов, несмотря на изменения в период дифференциации, дедифференциации и редифференциации в культуре in vitro возвращаются у регенерантов к исходной форме. Следовательно, можно считать, что данные процессы контролируются эпигенетически.

3.3.1. Применение бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, для оздоровления картофеля от вирусов и стимуляции регенерации и роста растений

Вирусное вырождение картофеля приносит самый большой вред производству картофеля. Оно уносит ежегодно до 30-50% урожая, а иногда и существенно больше. Именно это послужило причиной для изучения возможности использования способности нуклеаз подавлять размножение вирусов и применить эндонуклеазу для оздоровления растений картофеля с помощью биотехнологических методов.

Ранее, в ряде работ, проведенных в Институте цитологии и генетики СО РАН, была показана способность панкреатической дезоксирибонуклеазы (ДНК-азы) подавлять синтез вирусной ДНК и размножение ДНК-содержащих вирусов (Трухачев и др., 1967; Trukhachev, Salganik, 1967; Салганик, 1972). Также была показана способность рибонуклеазы (РНК-азы) подавлять синтез вирусной РНК и репродукцию различных РНК-содержащих вирусов (Салганик, 1972; Салганик, 1968; Salganik,1984).

Результаты этих исследований послужили стимулом для испытания способности нуклеаз подавлять размножение вирусов растений. Так было показано, что применение панкреатической РНК-азы в процессе получения безвирусного картофеля методом апикальной меристемы увеличивает выход здоровых регенерантов и стимулирует морфогенез (Табл. 4) (Салганик, Леонова, 1990; Салганик, Баталина, 1972). Под действием PНК-азы увеличивается устойчивость картофеля к вирусам. Поскольку применение дорогостоящей панкреатической РНК-азы для этих целей неэкономично, представлялось существенным исследовать на растениях противовирусное действие доступной и экономичной бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens штамм В-10 М-I. В работе был использован стерильный коммерческий препарат эндонуклеазы с активностью 10000-20000 ед. активности на миллиграмм препарата (МЕ), произведенный НИКТИ Биологически активных веществ.

Таблица 4. Влияние эндонуклеазы на регенерацию растений картофеля из меристемы и на количество безвирусных растений

Сорт Условия опыта Вычленено меристем Регенерировало растений Количество безвирусных растений

шт % шт %

Полет Контроль

Эндонуклеаза 56 17 30,4 7 41

Кемеровский ранний Контроль 37 4 10,8 1 25

Эндонуклеаза

47 13 27,8 6 46

В настоящей работе исследовалось влияние бактериальной эндонуклеазы на развитие апикальных меристем, на выход безвирусных регенерантов и освобождение от вирусов при микроклональном размножении, а также на рост, развитие и продуктивность растений картофеля при дальнейшем выращивании вне пробирочной культуры.

При выращивании апикальных меристем с целью освобождения от вирусов был проведен эксперимент на двух сортах картофеля Полет и Кемеровский ранний. В опытах в среду для апикальной меристемы после ее автоклавирования и остывания до 45°С добавляли раствор БЭ (бактериальной эндонуклеазы) из расчета 1000 МЕ активности лиофилизованного препарата на мл. среды, а в контрольные пробирки добавляли равный объем стерильной дистиллированной воды.

При микроклональном размножении изучение влияния БЭ проводили на выращенных в пробирках растениях четырех сортов картофеля Седов, Приекульский, Мутант-987, Xenia, зараженных вирусами картофеля групп L, X, M, S, У. В используемую для черенкования среду была добавлена бактериальная эндонуклеаза в количестве 200 МЕ на мл среды. В контроле использовали среды без БЭ.

В опыте использовали по 6 растений каждого сорта. Каждое растение расчеренковывалось и часть черенков (1-3) высаживали на опытные среды, а другую - на контрольные. После 20 дней выращивания, у растений брали верхушки и пересаживали на среды предыдущего состава. Остальная часть растения использовалась для иммуно-ферментного анализа на содержание вирусов.

При выращивании вычлененных меристем с целью освобождения растений картофеля от вирусной инфекции был проведен эксперимент на двух сортах картофеля: Полет и Кемеровский ранний. В опытном варианте в среду добавляли эндонуклеазу из расчета 1000 МЕ на мл среды, а в контрольные пробирки добавляли равный объем стерильной дистиллированной воды Данные опыта приведены в таблице 4. Как видно из этих данных, бактериальная эндонуклеаза оказывает стимулирующее действие на морфогенез и регенерацию. Так, количество регенерантов сорта Полет повышается в два раза: с I4,9% растений в контроле до 30,4% в опыте.

Повышается при этом и число здоровых растений среди регенерантов. При применении эндонуклеазы число свободных от вирусов растений среди регенерантов составляло 41%, а в контроле только 20%. Сходные результаты получены и на сорте Кемеровский ранний, у которого при применении эндонуклеазы процент регенерантов был 27,8% и только 10,8% в контроле. Соответственно почти в 2 раза увеличился и выход здоровых растений с 25% в контроле до 46% в опытном варианте с применением эндонуклеазы. С целью изучения возможности оздоровления картофеля от вируса при микроклональном размножении с помощью эндонуклеазы был проведен ряд опытов с введением в среду эндонуклеазы в концентрации 200 или 300 МЕ на мл среды. В контроле эндонуклеазу в среду не добавляли. В пробирки с этими средами были высажены черенки четырех сортов картофеля (Седов, Приекульский ранний, М-987 и Седов), зараженных 5 вирусами: L, Х, M, S, Y. Пocлe трехнедельного выращивания верхушки были срезаны и снова пересажены на такие же среды с эндонуклеазой. Во втором и третьем пассажах проводилось определение вирусности методом иммуноферментного анализа. Концентрация определялась спектрофотометрическим методом по окраске пероксидазы. Отрицательный контроль имел показатель поглощения 0,057 оптических единиц. Растения, имеющие показания ниже отрицательного контроля считали здоровыми.

Данные этих экспериментов показали, что титр вирусности в растениях, выращенных на среде с эндонуклеазой, снижается. У растений сорта М-987, где степень заражения была небольшой, даже появились единичные растения свободные от вируса. Суммарные данные по влиянию эндонуклеазы на содержание вирусных частиц в растениях картофеля четырех исследованных сортов даны в таблице 5.

Кроме контроля иммуноферментным анализом, содержание вирусов проверяли еще электронно-микроскопическим методом. В работах, выполненных совместно с Всесоюзным Институтом защиты растений, было также показано, что эндонуклеаза обладает противовирусным действием (табл. 6).

Таблица 6. Влияние эндонуклеазы на число вирусных частиц у картофеля по данным электронной микроскопии


загрузка...