Эпифизарная и тканевая регуляции  временнoй организации пролиферации обновляющихся тканей (14.09.2009)

Автор: Слесарев Сергей Михайлович

Определение антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. В качестве модели для изучения роли эпифиза в формировании биоритмов продукции тканевых регуляторов пролиферации служила печень белых крыс. Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени изучалась у интактных (n=50), эпифизэктомированных (n=50) и эпифизэктомированных с последующей инъекцией пептидов эпифиза (n=100) животных. Последним вводили пептиды эпифиза в 6 (n=50) или 18 часов (n=50). После декапитации и вскрытия беспородных белых крыс извлеченную печень замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере. Для получения комплексных экстрактов печеночных кейлона и антикейлона доли печени очищали от соединительнотканной капсулы, а ткань гомогенизировали. Дистиллированной водой из ткани печени извлекали водорастворимые компоненты, которые подвергали центрифугированию и спиртовому фракционированию охлажденным до +40С этанолом. Использовалась фракция, полученная при осаждении между 70 и 87% насыщения. Антирадикальную активность препаратов определяли на модифицированном хемилюминометре

ХЛМ 1Ц-01 (Пашков, 1991) по степени гашения хемилюминесценции в системе, генерирующей свободные радикалы и выражали в условных единицах на 1 мг белка. Получение препаратов и определение их антирадикальной активности проводили на базе кафедры биологии с экологией Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (зав. – профессор А.Н. Пашков). Для концентрирования и хранения кейлон-антикейлонных препаратов их лиофилизировали.

Для исследования биологических свойств кейлон-антикейлонных препаратов лиофилизированные фракции, полученные от крыс, декапитированных в дневные и ночные часы, вводили частично гепатэктомированным мышам внутрибрюшинно однократно в 18 часов. Выбор оптимальной дозы (5 мг/мышь) осуществляли на основе анализа данных литературы (Смирнов, 1998). Животных предварительно подвергали частичной гепатэктомии под эфирным наркозом по общепринятой методике (Stewart, 1979). В эксперименте использовались кейлон-антикейлонные препараты печени, полученные от крыс, декапитированных в 2100, 2400, 300 (группа 1) и 900, 1200, 1500 (группа 2). Контролем служили частично гепатэктомированные животные. На гистологических препаратах, окрашенных гематоксилин-эозином, осуществляли подсчет фигур митоза на 5000 гепатоцитов и выражали в ‰.

Гистологическая техника. Для исследования брали среднюю треть пищевода, проксимальный участок тощей кишки и трахеобронхиальные лимфатические узлы. Органы фиксировали в течение 1 часа в жидкости Карнуа, обезвоживали в спиртах и заключали в парафин. Серийные срезы пищевода и тощей кишки окрашивали гематоксилин-эозином. Срезы лимфатических узлов окрашивали пиронином-метиловым зеленым по Браше с докраской гематоксилином. Окрашенные срезы заключали в канадский бальзам.

Учет количества делящихся клеток производили в базальном слое многослойного плоского неороговевающего эпителия пищевода, концевых отделах продольно срезанных крипт тощей кишки на участке размером в 25 клеток с каждой стороны крипты от её дна и герминативном центре лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Митотический индекс (МИ) в промилле вычисляли как отношение количества делящихся клеток к 5000 изученных клеток эпителия пищевода, 1000 клеток эпителия тощей кишки и 2000 клеток герминативного центра. Статистическую обработку результатов проводили с использованием метода Фишера – Стьюдента.

Выявление и характеристика биоритмов. Выявление биоритмов пролиферации и продукции тканевых регуляторов деления клеток, а также определение их периодов осуществлялось методом наименьших квадратов и спектральным анализом значений МИ или антирадикальной активности. Компьютерные программы данных методов разработаны совместно с сотрудниками кафедр прикладной математики (д.ф.-м.н., профессор А.А. Бутов, к.ф.-м.н., доцент И.А. Санников) и теоретической физики (д.ф.-м.н., профессор В.М. Журавлев) Ульяновского государственного университета. Анализ циркадианных ритмов пролиферации обновляющихся тканей и антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени беспородных белых крыс проводили с использованием графически-параметрического метода (Романов и др., 1979; Филиппович, 1980).

Результаты и их обсуждение

Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов

пролиферации обновляющихся тканей

Временнaя организация пролиферации обновляющихся тканей интактных беспородных белых крыс. Важным моментом оценки влияния биологически активных веществ эпифиза на пролиферацию является изучение ритма деления клеток интактных животных и животных, освобожденных от каких-либо воздействий со стороны эпифиза. Суточная динамика пролиферации эпителия пищевода интактных беспородных белых крыс представлена на рисунке 3.

У интактных животных наблюдалось периодическое изменение МИ эпителия пищевода, которое характеризовалось монофазным ритмом на протяжении суток. Результаты графически-параметрического анализа динамики МИ указывают на то, что изменения МИ интактных животных скоррелированы с режимом освещения.

Рис. 3. Динамика МИ эпителия пищевода интактных беспородных белых крыс; (? МИ, ---- сглаженная кривая)

Аналогичный характер присущ суточной динамике пролиферации эпителия крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных беспородных белых крыс. Однако имеется органная специфика пролиферативных процессов, которая выражается в различии акрофаз ритма, абсолютной и относительной амплитуд, коэффициента синхронизации и ряда других параметров циркадианного ритма пролиферации (табл.2).

Отличие в положении акрофаз циркадианного ритма пролиферации различных обновляющихся тканей указывает на определенную лабильность параметров циркадианного ритма пролиферации. Положение акрофаз выявленных ритмов не является строго фиксированным и может смещаться в пределах 24-х часовой шкалы. Промежуток смещения акрофаз в пределах временнoй шкалы предложено называть “зоной блуждания акрофазы”. Наиболее выраженные изменения положения акрофазы ритма отмечаются в процессе роста и развития организма, а также во время смены сезонов года. Тем не менее, взаимосвязь подъема митотической активности с определенным временем суток сохраняется, что было продемонстрировано нами для ряда обновляющихся тканей. Для максимума митотической активности эпителиев пищевода и тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатических узлов расположение “зоны блуждания” приходится на вторую половину темновoго - начало световoго периода суток. Таким образом, циркадианный биоритм пролиферации характеризуется лабильностью в определенной “зоне блуждания”, которая соответствует условиям фоторежима.

Таблица 2

Параметры циркадианных ритмов МИ эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных беспородных белых крыс

Параметр Пищевод Кишечник Лимфатический узел

1 сутки 2 сутки 1 сутки 2 сутки 1 сутки 2 сутки

Мезор,‰ 9.27±1.36 61.4±2.2 25.8±1.68

Акрофаза,ч 900 600 2100 300 900 900

АФ,ч 300-1700 300-1100 1800-300 2400-600 500-1200 500-1200

Длительность АФ,ч 14 8 9 6 7 7

Середина

АФ,ч 1000 700 2230 300 1230 1230

АА,‰ 16.8 15 22 25.8 22.24 20.62

ОА,‰ 8.63 4.94 1.39 1.49 2.38 2.11

КС,1/ч 0.95 0.82 0.15 0.16 0.39 0.35

РМср,‰ 75.21±12.7 1466.7±29.7 205.7±50.2

РМАФср,‰ 45±9.8 530.15±116.14 68.7±0.2

Примечание: АФ - активная фаза ритма, АА - абсолютная амплитуда, ОА - относительная амплитуда, КС - коэффициент синхронизации МИ в ритме,

РМср - пул делящихся клеток в течение суток (среднее за двое суток),

РМАФср - пул делящихся клеток в течение АФ ритма (среднее за двое суток).

Данные спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов динамик МИ свидетельствуют о ритмической организации митотической активности эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов интактных животных с периодом, приближающимся к 24 часам. Кроме того, во всех указанных тканях выявлен ультрадианный ритм пролиферации c периодом около 9 часов. Совокупность биологических ритмов функций организма с различными периодами является одним из видов временнoй организации живых систем (Романов, 1995). Вероятно, первичными следует считать эндогенные ультрадианные ритмы. Внешние синхронизаторы, координируя работу регуляторных систем, формируют на их основе циркадианные ритмы. Возникновение ультрадианных биоритмов обусловлено цикличностью метаболических процессов в ткани (Бродский и др., 2006).

Временнaя организация пролиферации обновляющихся тканей беспородных белых крыс после эпифизэктомии. Эпифиз является необходимым звеном формирования циркадианных ритмов ряда функций организма. Он осуществляет преобразование нервных импульсов в гормональный сигнал. В системе управления циркадианными ритмами комплекс “супрахиазматические ядра – эпифиз” обеспечивает гармоничную адаптацию к меняющимся средовым факторам, в частности, к свету. Результаты нашего эксперимента подтверждают упомянутую функциональную схему, свидетельствуя о важной роли эпифиза в фотопериодическом контроле циркадианного ритма пролиферативной активности тканей организма. С целью выявления роли эпифиза в регуляции циркадианного ритма пролиферации была проведена экстирпация железы и изучена динамика МИ обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных.

Эпифизэктомия привела к исчезновению циркадианного ритма пролиферации всех изучавшихся тканей. Результаты спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показали отсутствие циркадианного ритма МИ. В то же время обнаружился выраженный ультрадианный ритм репродукции клеток с периодом от 7 до 13 часов.

На рисунке 4 представлена суточная динамика пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс. Колебания МИ на протяжении двух суток не обнаружили какой-либо связи с фоторежимом. Уровень пролиферации эпителия пищевода эпифизэктомированных животных был таким же, как у интактных, что выражалось в отсутствии различий (Р>0,05) между: 1) среднесуточными значениями МИ (8,45±0,97‰ и 9,27±1,36‰); 2) суточными пулами пролиферирующих клеток (66,4±16,2‰ и 75,2±12,7‰) животных обеих групп.

Рис. 4. Динамика МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных беспородных белых крыс; (? МИ, ---- сглаженная кривая)

Аналогичный характер присущ суточной динамике пролиферации эпителия крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Пролиферативная активность эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатических узлов в световой и темновой фазах фотопериода не имела статистически достоверных (Р>0,05) отличий. Таким образом, удаление эпифиза привело к рассогласованию циркадианной составляющей деятельности пролиферативной системы с условиями освещенности, и исчезновению циркадианного ритма пролиферации всех изученных тканей на 40-е сутки после эпифизэктомии. У эпифизэктомированных животных динамика митотической активности характеризуется наличием только ультрадианного ритма, периоды которого составили 11 часов в эпителии пищевода, 9 часов в эпителии крипт тощей кишки, 7 и 13 часов для клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. Это указывает на важную роль эпифиза в фотопериодическом контроле циркадианного ритма пролиферации. Регуляторная роль эпифиза установлена нами на различных моделях репродукции клеток. Кроме представленных в работе данных, нами показано исчезновение циркадианного ритма пролиферации сперматогоний беспородных белых крыс после эпифизэктомии (Слесарева и др., 2005).

Эпифизэктомия не вызывает морфологических изменений эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов (рис.5-7) беспородных белых крыс.

Исчезновение циркадианного ритма пролиферации у эпифизэктомированных животных позволяет предполагать участие биологически активных веществ эпифиза в его формировании. В настоящее время ритмогенную функцию эпифиза связывают с продукцией мелатонина, синтез и секреция которого имеет циркадианный характер (Кветная и др., 2005). Способность мелатонина подавлять пролиферацию различных тканей отмечена как в культуре, так и in vivo (Blask et al., 2005; Pizarro et al., 2008). Наличие рецепторов к мелатонину продемонстрировано для большинства клеток тканей организма (Korf et al., 2006). Однако вопрос о роли мелатонина в регуляции циркадианного ритма пролиферации продолжает оставаться дискуссионным.


загрузка...