Молекулярно-генетические механизмы активации тромбоцитов и чувствительности к антиагрегантным препаратам (14.03.2011)

Автор: Сироткина Ольга Васильевна

G36T P2Y12 72,3 26,7 1,0 14,4 80,7 17,6 1,7 10,5 0,09

У пациентов с ОКС только частота полиморфизма G36T P2Y12 имела тенденцию к увеличению по сравнению с донорами без ССЗ, относительный риск развития ОКС у носителей Т36 аллеля возрастал в 1,6 раза. Частоты остальных генотипов не отличались от таковой в группах Д, ИМс, ИБС, ИМм.

В группе ОКС также как у мужчин, перенесших ИМ в молодом возрасте, функциональная активность тромбоцитов была выше у носителей мутации Leu33Pro GP IIIa. В то же время у носителей мутантного аллеля G1622 P2Y1 степень АДФ-индуцированной агрегации оказалась ниже, чем у лиц с генотипом «дикого типа» (табл. 7). Следует отметить, что в литературе сведения о влиянии полиморфизма A1622G P2Y1 на функциональную активность тромбоцитов противоречивы. Найдено как усиление агрегационного ответа на АДФ у носителей G-аллеля (Hetherington S. et al, 2005), так и снижение агрегации при наличии GG генотипа (Fontana P. et al, 2005).

Таблица 7.

Зависимость степени АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов от генотипов Leu33Pro GP IIIa, A1622G P2Y1, C18T P2Y12 и G36T P2Y12 у пациентов с ОКС

Исследуемые генотипы Т (%) Достоверность различий p (между NN и NM+MM)

NN NM+MM

Leu33Pro GP IIIa 30,5±2,1 40,2±3,5 0,02

A1622G P2Y1 33,9±2,4 24,7±2,9 0,05

C18T P2Y12 34,7±2,6 32,2±2,6 0,4

G36T P2Y12 32,0±2,1 36,8±3,9 0,4

На основании исследования генетических вариантов ключевых тромбоцитарных рецепторов у пациентов с ССЗ можно заключить, что Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, С807Т GP Ia, Т13254С GP VI, Thr145Met GP Ib?, C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1 модулируют функциональную активность тромбоцитов и могут быть ассоциированы с риском развития сердечно-сосудистой патологии в различных поло-возрастных группах.

Анализ молекулярно-генетических механизмов высокой функциональной активности тромбоцитов

. et al, 1999). Для выяснения молекулярных механизмов, определяющих спонтанную агрегацию тромбоцитов, нами были проанализированы максимальный размер агрегатов (R макс) и максимальная скорость образования агрегатов (V макс, (R/мин) в зависимости от Leu33Pro GP IIIa, Ile843Ser GP IIb, уровня экспрессии генов GP IIb и GP IIIa, количества зрелых рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов (табл. 8). Максимальный уровень спонтанной агрегации у носителей аллеля Pro33 GP IIIa (генотипы ProPro и LeuPro) был почти в 1,5 раза выше, чем у доноров с генотипом LeuLeu, хотя скорость агрегации в этих группах достоверно не различалась. Исследуемые параметры не различались в зависимости от мутации Ile843Ser GP IIb.

Содержание GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов и концентрация тромбоцитов были одинаковыми в исследованных группах с различными генотипами Leu33Pro GP IIIa. Эти данные указывают на то, что повышение уровня спонтанной агрегации у доноров с мутацией Leu33Pro GP IIIa было обусловлено изменениями функциональной активности GP IIb-IIIa.

Таблица 8.

Параметры спонтанной агрегации, содержание GP IIb-IIIa и концентрация тромбоцитов в БТП у доноров с различными генотипами GP IIb-IIIa

Исследуемые параметры Leu33Pro GP IIIa Ile843SerGPIIb

LeuLeu (n=14) ProPro+LeuPro (n=11) IleIle (n=5) IleSer+SerSer (n=6)

R макс 1,26(0,06 1,80(0,24* 1,19±0,06 1,31±0,11

V макс ((R/мин) 0,59(0,09 0,62(0,10 0,69±0,15 0,62±0,18

Содержание GP IIb-IIIa (*103 /на клетку) 56,4(1,5 60,4(3,5 58,0±4,3 56,7±2,2

Концентрация тромбоцитов в БТП (103/мкл) 224(10 224(15 258±9 244±18

*p=0,03 – между носителями LeuLeu и LeuPro+ProPro

Как было показано ранее в исследовании Vijayan и соавт (Vijayan K.V. et al, 2000), выполненном на модельных клетках, замена Leu33Pro приводит к усилению сигнальных и адгезивных функций рецептора GP IIb-IIIa. Возможно, именно эти эффекты являются причиной повышенной спонтанной агрегации у носителей аллеля Pro33 GP IIIa. Нами была определена существенная индивидуальная вариабельность в содержании GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов от 44,8*103 до 82,7*103 молекул на клетку, которая влияла на интенсивность спонтанной агрегации – выявлена корреляция между уровнем спонтанной агрегации и количеством GP IIb-IIIa на поверхности тромбоцитов (R=0,39, p=0,05). Уровень экспрессии генов GP IIb и GP IIIa не влиял на показатели спонтанной агрегации. Полученные данные свидетельствует о том, что на интенсивность спонтанной агрегации влияет как генетический полиморфизм Leu33Pro GP IIIa, так и количество рецептора GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов.

Анализ соотношения количества рецепторов GP IIb-IIIa и генотипа Leu33Pro GP IIIa показал достоверные различия в группе доноров (n=50) – количество рецептора было выше у носителей аллеля Pro33 (рис. 2).

Рис. 2. Количество рецепторов GP IIb-IIIa на мембране тромбоцитов у носителей аллельных варианов Leu33Pro GP IIIa

Мы проанализировали нуклеотидную последовательность промоторной области гена GP IIIa у доноров с высокой плотностью рецепторов GP IIb-IIIa и обнаружили неописанный ранее в российской популяции полиморфизм A-425C GP IIIa. Генетический вариант A-425C оказался сцеплен с Leu33Pro, что согласуется с данными других исследований (Negrier C. et al, 1998; O'Halloran A. et al, 2005). Таким образом, связь между количеством рецептора и генотипом Leu33Pro GP IIIa можно объяснить изменением структуры промоторной области и регуляции работы гена.

Ни максимальный уровень спонтанной агрегации, ни ее скорость не зависели от генетических вариантов C18T P2Y12, G36T P2Y12 и A1622G P2Y1. Не было найдено корреляции между R макс или V макс и количеством рецепторов P2Y12, P2Y1 и P2X1 на мембране тромбоцитов исследованных доноров. На параметры спонтанной агрегации не влиял и уровень экспрессии генов P2Y1 и P2X1. В то время как уровень экспрессии гена P2Y12 коррелировал со скоростью спонтанной агрегации – R=0,61 (p=0,047).

В группе доноров с увеличением скорости АДФ-индуцированной агрегации была ассоциирована мутация Leu33Pro GP IIIa, а Ile843Ser GP IIb – с увеличением степени АДФ-индуцированной агрегации (табл. 9).

Таблица 9.

Параметры АДФ-индуцированной агрегации в зависимости от генотипов рецептора GP IIb-IIIa у доноров без ССЗ в анамнезе

Исследуемые параметры Leu33Pro GP IIIa Ile843SerGP IIb

LeuLeu (n=14) ProPro+LeuPro (n=8) IleIle (n=10) IleSer+SerSer (n=22)

Т (%) 26,6(5,3 30,8(70,3 40,7±7,8 60,3±4,7*

V (%/мин) 31,7(3,4 47,3(6,3** 29,6±5,4 32,0±3,2

*p=0,049 – IleSer+SerSer против IleIle; **p=0,08 – ProPro+LeuPro против LeuLeu

. et al, 2001).

Рис. 3. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикционного анализа гена GP IIIa: 1 – маркер молекулярного веса pBR322 HaeIII; 2 – ПЦР-продукт; 3 – гаплотип Pro33Pro33/Leu40Arg40; 4,5 – гаплотип Leu33Pro33/Leu40Arg40; 6 – генотип Pro33Pro33; 7 – «дикий» генотип Leu33Leu33; 8 – генотип Leu33Pro33

В ходе исследования при генотипировании Leu33Pro GP IIIa в группе из 359 человек у 7 исследуемых (2%) нами была обнаружена не описанная ранее мутация гена GP IIIa, сцепленная с Leu33Pro GP IIIa (рис. 3). Сиквенирование исследуемого участка гена GP IIIa показало наличие нуклеотидной замены T1585G, что приводит к замене лейцина на аргинин в 40 положении аминокислотной последовательности белка. В результате данной мутации появляется дополнительный сайт рестрикции для эндонуклеазы MspI. Анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у гетерозиготного носителя гаплотипа Leu33Pro33/Leu40Arg40 гена GP IIIa выявил нетипичную картину – при индукции АДФ в любой концентрации (в том числе при низких пороговых дозах – 1,25 мкМ) возникал однотипный ответ – одноволновая кривая с максимальной амплитудой от 63% до 80%, характеризующей высокую степень агрегации, и с высокой скоростью агрегации. При этом отсутствовала тенденция к дезагрегации даже на малых дозах АДФ. Следует отметить, что у обследованного носителя новой мутации гена GP IIIa в анамнезе не зафиксировано ни одного тромботического эпизода. Показатели коагулограммы находились в пределах нормы. Тем не менее, проведенный анализ АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов позволяет предположить, что в момент тромботической агрессии вероятность формирования тромбоцитарных агрегатов и нарушения кровообращения, особенно в зоне микроциркуляции, у такого пациента выше, чем у индивидуумов с «диким» генотипом или носителей одной только мутации Leu33Pro гена GP IIIa. В литературе нами было найдено единственное сообщение Bojesen S. E. и соавт. о гетерозиготном носительстве Leu40Arg гена GP IIIa, частота которого среди 9242 обследованных раковых пациентов Copenhagen City Heart Study и Danish Cancer Registry составила 0,62% (Bojesen S.E. et al, 2003). Однако авторы не исследовали функциональную активность тромбоцитов у выявленных носителей Leu40Arg и классифицировали указанных пациентов только по их генотипу Leu33Pro GPIIIa.


загрузка...