Нейропептиды и субстраты энергетического обмена в терапии тяжелых отравлений депримирующими веществами (экспериментальное исследование) (14.02.2011)

Автор: Башарин Вадим Александрович

Агонисты глутаматных рецепторов МК-801 в/б 0,14 ( 0,001

Кетамин в/б 0,25 ( 0,01

Бензодиазепины Феназепам в/б **

Диазепам в/б **

Холиномиметики Карбофос в/б 0,750 ( 0,009

Холинолитики Атропин в/б 0,250 ( 0,014

Вещества общеядовитого действия Нитрит натрия в/б 0,070 ( 0,002

Нитробензол в/б 0,40 ( 0,06

Примечания: * – среднесмертельные дозы для веществ по данным литературы,

** ? введение максимально разрешенного объема раствора фармакопейного препарата (5 мл) не позоляло определить ЛД50

Для экспериментальной терапии острых отравлений были использованы субстраты энергетического обмена: глюкоза, сукцинат, цитрат и пируват натрия – субстраты цикла Кребса; лактат натрия ? субстрат лактатдегидрогеназной реакции, фосфокреатин (препарат «Неотон», Alfa Wassermann spa, Италия) – субстрат креатинкиназной реакции; K-Mg-аспарагинат (препарат «Панангин», Gedeon Richter Ltd, Венгрия) – компонент малат-аспартатного шунта транспорта НАДН. Препараты вводили внутрибрюшинно в дозе 5 ммоль/кг. Комплексный препарат «Цитофлавин» («Полисан», Россия) вводили внутрибрюшинно в дозе 5 ммоль/кг (в пересчете по сукцинат-аниону). Глюкозу, сукцинат, цитрат, лактат и пируват натрия растворяли в физиологическом растворе и доводили рН раствора до 7,4. Растворы субстратов вводили внутрибрюшинно через 0,5; 1 или 3 ч после введения токсикантов.

Для оценки эффективности пептидов были выбраны фармакологические препараты, зарегистрированные в Российской Федерации, которые могут быть введены парентерально или интраназально: кортексин («Герофарм», Россия), церебролизин («Ebewe Neuro Pharma», Германия), семакс («Пептоген», Россия), дельтаран («ИЦ Комкон», Россия). Дополнительно исследовали экспериментальный препарат ПИТ-10 («ИЦ Комкон», Россия), содержащий дельта-сон индуцирующий пептид (ДСИП).

При разработке экспериментальных моделей использовали показатели неврологического статуса и витальных функций (Буреш Я. и др., 1991). Для оценки неврологического статуса у животных исследовали следующие показатели: поведение животных (ПЖ), реакция на обонятельный (пищевой) раздражитель (РО), аудиомоторная реакция (АР), поисковая реакция (ПР), рефлекс хватания за решетку (РХР), рефлекс переворачивания (РП), тонус мышц (ТМ), тестирование равновесия на наклонной поверхности, тестирование равновесия на горизонтальном стержне (без вращения) (ТГС), проба на нашатырный спирт (ПНС), тактильно-болевая чувствительность (БР), рефлекс сгибания задних конечностей (РС), состояние зрачков (СЗ) и их размер (РЗ), зрачковый рефлекс (реакция зрачков на свет) (ЗР), мидриаз и отсутствие зрачкового рефлекса (МОР), корнеальный рефлекс (КР), глоточный рефлекс (ГР), судорожная активность (СА). Неврологические показатели у крыс были разделены по степени тяжести и выражены в баллах.

Дополнительно у животных оценивали вегетативные показатели: частоту сердечных сокращений (ЧСС), частоту дыхания (ЧД), температуру. Запись ЭКГ производили на приборе «Поли-Спектр-8В» (Россия). Показатели ЭКГ рассчитывали по II стандартному отведению в программе «Поли-Спектр». Ректальную температуру (?С) определяли с помощью прибора ТПЭМ-1 (Россия). Подсчет частоты дыхательных движений производили визуальным методом. Дополнительно оценивали характер и ритм дыхания, выражали его в баллах. Определение суммационно-порогового показателя (СПП) выполняли на приборе «Электростимулятор ЭС-50-1» (Россия). Восстановление животных после острой интоксикации оценивали, используя методику «открытое поле», на оборудовании фирмы «Openscience» (Россия).

Биохимические показатели исследовали в смешанной крови и головном мозге животных. Кровь собирали в пробирки с использованием антикоагулянта ЭДТА натрия. В пробирки предварительно помещали 3% раствор фторида натрия как ингибитор гликолиза. Содержание глюкозы, пировиноградной и молочной кислот определяли с использованием наборов биохимических реактивов фирмы «Ольвекс Диагностикум» (Россия) на спектрофотометре EPOCH («BioSystems», США).

Оценку интенсивности потребления кислорода и реактивности тканевого дыхания осуществляли в гомогенатах головного мозга крыс (Носов А.В., 1998). У животных оценивали интенсивность потребления кислорода закрытым камерным методом в аппарате Regnault (Ольнянская Р.П. и др., 1959). Определение потребления кислорода гомогенатами проводили манометрическим методом в аппарате Варбурга Wa 0110 («Glaswerke Ilmenau», Германия).

Изменение проницаемости гематоэнцефалического барьера при отравлениях депримирующими веществами проводили с использованием суправитального красителя синего Эванса (Yepes M. et al., 2003). Морфологическое исследование проводили у экпериментальных животных, которых подвергали эвтаназии (доза тиопентала-натрия составляла 100 мг/кг). Головной мозг фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и проводили по стандартной методике приготовления гистологических препаратов. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также по методу Циль-Нильсена (Меркулов Г.А., 1956).

При исследовании распределения токсикантов после однократного внутрибрюшинного введения токсикантов в среднелетальной дозе концентрацию этанола, тиопентала натрия и 1,4-бутандиола у экспериментальных животных оценивали в течение 1 сут в крови и тканях головного мозга. До момента исследования (в течение 2 ч) пробы хранились в холодильнике при температуре +4?С. Содержание этанола в биопробах определяли на газовом хроматографе «МХК» (Россия), а концентрацию тиопентала натрия и 1,4-бутандиола ? на газовом хроматографе Agilent 6890 (Германия) (Бушуев Е.С. и др., 2010).

Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием программ STATISTICA (version 6), StatPlus2008 Professional и Excel 2003 for Windows.

При создании моделей оценки депримирующих эффектов первый этап статистической обработки состоял в вычислении описательных статистик для непрерывных показателей и частотных таблиц для дискретных показателей. Для анализа связей дискретных показателей вычислялись 2-х и 3-х входовые таблицы сопряженности, однородность таблиц оценивалась с помощью критерия ?2 Пирсона и ?2 максимального правдоподобия. Были вычислены ранговые корреляции ? (гамма). Сравнение показателей (средних значений или распределений) в группах проводили, используя критерий Манна-Уитни.

Для оценки динамики различных показателей применяли ранговый дисперсионный анализ Кендалла. Для прогноза гибели на 1 сут и выбора переменных в модели использовали пошаговый дискриминантный анализ. Пошаговый регрессионный анализ использовали для выбора переменных и построения решающих правил – приближения экспертной оценки линейными комбинациями показателей тестов и вегетативных показателей на каждом сроке оценки и по всем срокам в целом. Также для построения решающих правил использовали построение бинарных деревьев классификации с ветвлением по группирующей переменной (Гайдышев И., 2001; Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002).

Летальность животных (%) рассчитывали, используя таблицы В.С. Генеса (1967). Проверку значимости различий по летальности между группами осуществляли с помощью точного метода Фишера. Вывод о статистической достоверности различий между группами принимали при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Подходы к экспериментальному моделированию депримирующих эффектов при интоксикациях

На основании проведенного анализа данных литературы были выбраны соединения, вызывающие развитие токсической комы у человека, и предложена их рабочая классификация, разделяющая вещества на первично и вторично депримирующего действия. В основу разделения веществ на группы был положен механизм токсического действия веществ, приводящий к угнетению функций ЦНС (депримации). Химические соединения, относящиеся к первично депримирующим веществам (депримирующие агенты), способны угнетать функции ЦНС путем влияния на механизмы генерации, проведения и передачи нервного импульса. Угнетение функций ЦНС при интоксикациях химическими соединениями второй группой возникает вследствие развития типовых патологических процессов, таких как гипоксия, нарушения электролитного баланса, расстройств микроциркуляции и других видов нарушения гомеостаза.

Для экспериментального исследования были выбраны вещества с различными механизмами токсического действия, относящиеся к первично и вторично депримирующим соединениям. Разработка экспериментальных моделей депримирующих эффектов выполнялась с использованием созданного алгоритма (рис. 1). Учитывая, что наиболее тяжелым состоянием при отравлениях депримирующими веществами является кома, то именно ее моделирование было приоритетным в нашем исследовании.

Рисунок 1. Алгоритм создания экспериментальной модели токсической комы

У экспериментальных животных, отравленных депримирующими веществами, на основании изучения неврологических показателей и витальных функций были выделены шесть состояний: 1) физиологическая норма, 2) оглушение, 3) сопор, 4) кома умеренная, 5) кома глубокая, 6) кома запредельная. В целом подобная градация соответствует состояниям, выделяемым в клинике у человека. Разделение оглушения на умеренную и глубокую степень в эксперименте на лабораторных животных невозможно.

При помощи разработанного алгоритма был проведен скрининг токсикантов и выявлено, что целый ряд веществ, способных вызвать у человека угнетение сознания от оглушения до комы, при введении животным не позволяет создать весь диапазон депримирующих эффектов. Фентанил, морфин, дихлорэтан, карбофос, азалептин, атропин, этиленгликоль, нитрит натрия и нитробензол, 1,1-диметилгидразин не могут рассматриваться как самостоятельные средства для моделирования коматозных состояний. Депримирующие эффекты, в том числе и кома, наблюдались для этанола, 1,4-бутандиола, кетамина, МК-801, тиопентала натрия и оксибутирата натрия.

Для создания модели токсической комы были выбраны следующие соединения: этанол, оксибутират натрия, 1,4-бутандиол и тиопентал натрия. Этанол относится к веществам с неэлектролитным действием, тиопентал натрия и оксибутират натрия ? агонисты ГАМКа-рецепторов. Исследование вклада «неэлектролитного» действия целой молекулы 1,4-бутандиола и специфического влияния его метаболитов в формирование депримирующих эффектов при тяжелых отравлениях 1,4-бутандиолом с использованием ингибитора алкогольдегидрогеназы изовалериамида показало, что депримация при введении спирта связана преимущественно с действием его продуктов метаболизма.

На основании результатов неврологического тестирования и показателей витальных функций на фоне острого отравления депримирующими агентами методами статистического анализа были разработаны шкалы балльной оценки неврологического статуса с расчетом индекса тяжести угнетения нервной системы (ИТНН) и тяжести состояния животных с расчетом индекса глубины комы (ИГК), а также критерии прогноза исхода интоксикаций.

Расчет индекса тяжести неврологических нарушений (ИТНН) позволяет с достаточно высокой точностью (более 80 % правильных ответов) описать состояние животных: от физиологической нормы до выраженного угнетения функций ЦНС ? терминальной комы. Для каждой разработанной модели интоксикации были статистически обоснованы коэффициенты значимости признаков (табл. 2).

Таблица 2

Оценка тяжести неврологических нарушений при интоксикациях депримирующими агентами

Токсикант Формула расчета ИТНН Решение

Этанол ИТНН = 5*ПЖ + 4*ГР + 3*БР + 2*РС + 2*ЗР + КР ИТНН более 55 баллов – физиологическая норма; от 46 до 55 баллов – оглушение; от 36 до 45 баллов – сопор; от 26 до 35 баллов – кома умеренная; от 18 до 25 баллов – кома глубокая, терминальная кома ? 17 баллов и меньше.

Оксибути-рат натрия ИТНН = 8*МОР + 4*ПЖ + 4*ГР + 3*АР + 2*БР + 2*ПНС + КР + РС ИТНН более 67 баллов – физиологическая норма; от 58 до 67 баллов – оглушение; от 50 до 57 баллов – сопор; от 41 до 49 баллов – кома умеренная; от 34 до 40 баллов – кома глубокая и 33 балла и менее ? терминальная кома

1,4-бутан-диол ИТНН = 5,5*ГР + 3*БР + 3*ЗР + 2*РП + 2*КР + 2*ТМ + 2*ПР + 1,5*СЗ + ПНС ИТНН более 65 баллов – физиологическая норма; от 56 до 65 баллов – оглушение; от 46 до 55 баллов – сопор; от 36 до 45 баллов – кома умеренная; от 26 до 35 баллов – кома глубокая и 25 баллов и менее ? терминальная кома.

Тиопентал натрия ИТНН = 5*ПЖ+ 3*ТГС + 2*БР + 3*РС + 3*МОР + 2*КР + ГР

ИТНН более 57 баллов – физиологическая норма; от 47 до 57 баллов – оглушение; от 37 до 46 баллов – сопор; от 30 до 36 баллов – кома умеренная; от 25 до 29 баллов – кома глубокая и менее 25 баллов ? терминальная кома.


загрузка...