Биохимические механизмы повреждения мужской репродуктивной системы при действии полихлорированных бифенилов и фармакологическая коррекция выявленных нарушений (экспериментальное исследование) (13.09.2010)

Автор: Аглетдинов Эдуард Феликсович

Материалы и методы исследования. Эксперименты выполнены на 1250 белых беспородных крысах-самцах половозрелого возраста (3 мес.) массой 180-220 г. Животные содержались в виварии при 12-часовом цикле день/ночь в условиях постоянной температуры и влажности на стандартной диете. Эксперименты выполнены в соответствии с требованиями приказов №1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г., №267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986) по содержанию, кормлению, уходу за подопытными животными, выводу их из эксперимента и последующей утилизации.

Интоксикацию вызывали воздействием отечественной смеси ПХБ «Совол», включающей 26% тетра-, 64,6% пента-, 9% гексахлорбифенилов и следовые количества гептахлорбифенилов. Учитывая, что ведущим путем поступления полихлорбифенилов в организм человека и животных считается пероральный, экспериментальную интоксикацию вызывали внутрижелудочным введением совола в составе оливкового масла один раз в сутки с помощью специального металлического зонда.

Все животные были разделены на 6 групп. Самцы 2-й и 5-й групп подвергались воздействию совола в ежесуточной дозе 5 мг·кг-1 веса тела в течение 30-и и 60-и дней соответственно. Крысы 3-й и 6-й групп получали поллютант в количестве 10 мг·сут·кг-1 на протяжении 30-и и 60-и дней соответственно. Таким образом, суммарная токсическая экспозиция крыс 5-й и 6-й групп составляла 0,05 ЛД50 (300 мг·кг-1) и 0,1 ЛД50 (600 мг·кг-1), установленных для совола. Крысам контрольных групп (группы 1 и 4) вводили оливковое масло в тех же объемах - по 1,0 мл в течение 30 и 60 дней соответственно. В отдельных сериях экспериментов моделировали подострое отравление крыс (28 суток), при котором суммарная токсическая экспозиция крыс групп составляла 0,05 ЛД50 и 0,1 ЛД50.

Животных умерщвляли под легким эфирным наркозом путем декапитации – группы 2 и 5 на 30-й день, группы 3 и 6 на 60-й день эксперимента. Собирали кровь, извлекали для исследования семенники, эпидидимис, семенные пузырьки, вентральную простату, печень.

Эксперименты по изучению эффективности применения фармакологических препаратов с целью патогенетической коррекции токсических эффектов полихлорбифенилов выполнялись в два этапа. На первом осуществлялась предварительная оценка влияния препаратов «Триовит», «Селмевит», «Иммурег» на антиоксидантный статус печени, семенников и эякулята крыс на фоне подострой интоксикации полихлорированными бифенилами (28 дней в дозе 10 мг·сут·кг-1). Препараты вводили перорально с помощью специального зонда, начиная с 14-го дня подострой интоксикации. При выборе лечебных доз руководствовались подходами, описанными в литературе [Мышкин С.А., 2000; Бышевский А.Ш., 2006;] и общепринятой схемой использования фармакологических препаратов в пересчете на крыс [Гуськова Т.А., 1990]. Забой животных всех групп осуществляли на 28-й день.

На втором этапе была использована модель субхронической интоксикации соволом (60 дней по 10 мг·сут·кг-1). В этой серии экспериментов применяли «Селмевит», «Иммурег» и их комбинацию. Препараты вводили в тех же дозах, начиная с 30 дня экспериментального отравления. Группа 1 (контроль) получала оливковое масло, группа 2 - совол, группы 3, 4, 5, помимо токсиканта - селмевит, иммурег, комбинацию селмевит+иммурег, соответственно. Эвтаназию животных осуществляли на 60-й день экспериментального отравления.

В сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) содержание тестостерона, эстрадиола, лютеинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) трийодтиронина (Т3), тироксина (Т4), тиреотропного гормона (ТТГ) с использованием стандартных тест-систем производства «DRG Diagnostics» (Германия). Тестикулярные и сывороточные концентрации ингибина В и активина А определяли с применением тест-систем производства фирмы DSL (США).

В тканях акцессорных органов исследовали содержание фруктозы [Mann Т., 1954], активности кислой фосфатазы (ЕС 3.1.3.2) [Paquin R., 1984] и нейтральной гликозидазы (ЕС 3.2.1.20) с помощью набора производства FertiPro N.V., (Belgium).

В эякуляте и гомогенатах тканей определяли содержание глутатиона восстановленного (ГВ) [Гаврилова А.Н., 1986; Карпищенко А.И., 1997], свободных сульфгидрильных групп (ССГ) [Bellomo G., 1990], аскорбата [Omaye S.T. et al., 1979], токоферола [Desai I.D., 1984], активности глутатионпероксидазы (ГПО) (EC 1.11.1.9, GPx) [Rotruck J.T., 1973; Гаврилова А.Н., 1986], глутатионредуктазы (ГР) (EC 1.6.4.2, GR) [Carlberg I. & Mannervik B. 1985], глутатион-S-трансферазы (ГТ) (EC 2.5.1.1.8, GST) [Habig W.H., 1974], ?-глутамилтрансферазы (ГГТ) (EC 2.3.2.2, ?-GT) [Orlowski M. & Meister A., 1965], каталазы (EC 1.11.1.6, CAT) [Королюк М.А., 1988], супероксиддисмутазы (СОД) (EC 1.15.1.1, SOD) [Murklund S. & Marklund G., 1974].

Концентрацию соединений, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), и общую антиокислительную активность (ОАА) изучали с использованием диагностических наборов производства ООО «Агат-Мед» (Россия) и по Клебанову Г.И. (1988), соответственно. Содержание окисленных белковых производных определяли спектрофотометрическим методом, предложенным Дубининой Е.Е. (1995).

В лизате сперматозоидов определяли содержание общего белка биуретовым методом, альбумина с использованием бромкрезолового зеленого, мочевой кислоты энзиматическим кoлориметрическим методом с уриказой и пероксидазой, фруктозы по Mann Т. (1954), глюкозы глюкозооксидантным методом, активности щелочной фосфатазы (ЕС 3.1.3.1) (ЩФ) с помощью п-нитрофенилфосфата, аспартатаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.1) (АсТ), аланинаминотрансферазы (ЕС 3.6.1.2) (АлТ), лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27) (ЛДГ) кинетическими УФ-методами.

В тканях исследовали содержание АТФ [Lamprecht W., Trautschold I., 1965], окислительный метаболизм 1,4-14С-сукцината, 1,2-14С-(-кетоглутарата и 2-14С-пирувата - по выделению 14СО2, содержание НАДФН, интенсивность биосинтеза белка по скорости включения [2-14С]-гистидина и [2-14С]-аланина в состав суммарных белков гомогенатов тканей, активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (ЕС 1.1.1.49) (Г-6-Ф ДГ) [Прохорова М.И., 1982], общего белка [Lowry O., 1951].

При морфометрическом исследовании тестикулярной ткани проводили подсчет сперматогоний, сперматоцитов, сперматид и сперматозоидов [Рыжаков Д. И. и др., 1980; Косюга Ю.И. и др., 1994; Шевантаева О.Н. и др., 1995].

Эякулят у самцов крыс получали путем трансректальной электростимуляции семенного бугорка через слизистую прямой кишки [Рыжаков Д.И., Молодюк А.В., Артифексов С.Б, 1980].

Оценку оплодотворяющей способности проводили по стандартной методике in vivo. Для этого самцов, подвергшихся интоксикации, помещали в одну клетку с интактными самками в (1 самец : 2 самки). Через неделю самок отсаживали. После родоразрешения производили подсчет потомства.

Статистическую обработку данных выполняли с помощью пакета Statistica 6.0 фирмы StatSoft. В группах выборки оценивали следующие параметры: значения медианы, нижний и верхний квартили. Для оценки достоверности различий использовали непараметрический критерий (U) Манна–Уитни с поправкой Бонферонни. Корреляционный анализ полученных в эксперименте данных проводили по Спирмену.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Влияние полихлорированных бифенилов на мужскую репродуктивную систему экспериментальных животных.

При оценке гормонального статуса экспериментальных животных обнаружено достоверное снижение сывороточной концентрации тестостерона уже при непродолжительном действии малых доз полихлорбифенилов (5 мг·сут·кг-1) до 54,3% от показателей интактных самцов, усиливающееся с увеличением дозы и длительности интоксикации (рис. 1).

Рисунок 1. Концентрации гормонов в сыворотке крови самцов крыс на 30-й и 60-й дни отравления соволом в различных дозах (% от контроля)

Плазменное содержание стимулирующего андрогенопоэз лютеинизирующего гормона при этом отнюдь не увеличивалось, а, либо не отличалось от уровня контроля при экспозиции меньшими дозами ксенобиотика, либо заметно уменьшалось в условиях большей интенсивности и длительности интоксикации. Аналогичные результаты были получены при определении сывороточной концентрации другого гипофизарного гонадотропина - ФСГ, контролирующего сперматогенез. Об эндокринотоксичности ПХБ на гипофизарном уровне также свидетельствуют результаты определения ТТГ в крови крыс, содержание которого также снижалось на фоне резкого падения уровня тиреоидных гормонов. Концентрация в крови крыс эстрадиола, образующегося в мужском организме преимущественно в результате внетестикулярного метаболизма тестостерона, также значительно уменьшалась, однако лишь к окончанию экспериментальной интоксикации полихлорбифенилами - до 61,4-70%.

В отдельной серии экспериментов нами было выполнено динамическое изучение количественных и качественных параметров спермы крыс на фоне отравления полихлорбифенилами в различных дозах. Для этого у интактных половозрелых самцов методом трансректальной электростимуляции был получен эякулят и выполнено исследование исходного уровня показателей спермограммы (0 день). Затем животные были разделены на две равные группы, которым ежедневно вводили совол в дозе 5 мг·кг-1 (группа 1) и 10 мг·кг-1 (группа 2). На 15-е, 30-е, 45-е, 60-е сутки наблюдения на фоне продолжающейся интоксикации у животных указанным способом получали и исследовали эякулят. Согласно полученным данным у животных обеих групп зафиксировано последовательное ухудшение основных параметров спермограммы (таблица 1). Зарегистрированное уменьшение общего содержания половых клеток в сперме крыс обеих групп достигало уровня статистически значимых отличий на 45-е и 60-е сутки воздействия ксенобиотика. Общая концентрация сперматозоидов в эякуляте крыс группы 1 к 45-му дню составила 77,3%, а у самцов группы 2 – 65,5% от исходного уровня. На 60-й день экспериментальной интоксикации ПХБ падение общего содержания гамет в сперме этих животных продолжилось и составило 67,1% и 54,0% от исходного уровня, соответственно.

Более ранние нарушения в структуре спермограммы выявлены при оценке функциональных свойств сперматозоидов. Уже на 15-й день отравления поллютантом в меньшей дозе (5 мг·сут·кг-1) доля спермиев с поступательным характером движения достоверно снижалась на 14,5% - за счет увеличения относительного содержания малоподвижных клеток на 17,3% и неподвижных гамет на 68,3%. Однонаправленные, но более выраженные сдвиги были зарегистрированы в эякуляте крыс, получавших бoльшую дозу токсиканта. К окончанию срока наблюдения (60 дней) у самцов этой группы сперматозоиды с поступательной двигательной активностью отсутствовали, а доля неподвижных половых гамет достигала 43,2%, тогда как относительное содержание последних в сперме данных животных до начала введения совола не превышала 3,0%.

Специальная серия экспериментов была посвящена изучению некоторых параметров фертильности самцов крыс, подвергнутых отравлению полихлорированными бифенилами при их спаривании с интактными самками.

Таблица 1 – Концентрация и двигательная активность сперматозоидов в эякуляте крыс, подвергшихся воздействию соволом в дозе 5 мг·сут·кг-1

1. 0 день 2. 15 день 3. 30 день 4. 45 день 5. 60 день

концентрация,

млн/мл 44,0

[35,0;55,0] 43,0

[34,0;54,0]

р1-2=0,4876 38,00

[29,0;48,0]

р1-3=0,1530

р2-3=0,1779 34,0

[27,0;43,0]

р1-4=0,0373

р2-4=0,0550

р3-4=0,2530 29,5

[23,0;37,0]

р1-5=0,0042


загрузка...