Роль гуморальных и клеточных факторов иммунной системы в контроле развития плаценты в норме и при гестозе (13.07.2009)

Автор: Соколов Дмитрий Игоревич

В плаценте при гестозе запускаются компенсаторные механизмы защиты против избыточных антиангиогенных, апоптогенных стимулов и цитотоксических эффектов лимфоцитов матери, к которым относится повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGF? и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL при одновременном снижении экспрессии Fas, FasL и повышенной экспрессии TRAIL.

Некоторые из обнаруженных нами изменений, в частности, увеличение продукции тканью плаценты при гестозе секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1 и sVE-cadherin, являются отражением нарушения функций клеток плаценты. Повышение концентрации sICAM-1 в сыворотке периферической крови беременных с гестозом свидетельствует об активации лейкоцитов периферической крови и нарушении функций эндотелиальных клеток кровеносного русла.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное сопоставление иммунологических механизмов, контролирующих физиологическое развитие плаценты и особенностей иммунологической регуляции и иммунопатологических механизмов при гестозе.

Впервые выявлено усиление функции адгезии к эндотелиальным клеткам линии EA.Hy926 у мононуклеаров периферической крови беременных с гестозом по сравнению со здоровыми беременными.

Впервые показана более выраженная способность эндотелиальных клеток линии EA.Hy926 поглощать липиды из сывороток беременных с гестозом по сравнению с сыворотками здоровых беременных. Также впервые выявлена повышенная способность моноцитов периферической крови беременных с гестозом в сравнении с моноцитами периферической крови здоровых беременных поглощать липиды из аутологичной сыворотки крови.

Установлено, что продукция тканью плаценты секреторных вариантов поверхностных молекул sVEGF-R1, sVE-cadherin, sICAM-1, sFas, sFasL не вносит существенного вклада в их накопление в периферической крови. В то же время, повышение в сыворотке крови беременных женщин уровня sICAM-1 можно расценивать как отражение системной эндотелиальной дисфункции и активации лейкоцитов при гестозе.

Впервые продемонстрировано, что снижение экспрессии проангиогенных и антиангиогенных факторов, секреции IL-6, IL-8, а также увеличение секреции IFN?, IL-4, IL-10 в плаценте в динамике от первого к третьему триместру физиологически протекающей беременности не сопровождается изменением интенсивности апоптоза. В отличие от этого при гестозе снижение экспрессии ангиогенных факторов, увеличение секреции IL-6, IL-8 и экспрессии антиангиогенных и проапоптогенных факторов в плаценте сопровождается апоптотической гибелью преимущественно клеток трофобласта и эндотелиальных клеток плодовых сосудов.

Впервые обнаружено, что повышение секреции ангиогенина, PDGF, TGF? и растворимых форм поверхностных рецепторов sFas, sFasL, а также снижение экспрессии мембранных рецепторов Fas, FasL и повышение экспрессии рецептора TRAIL отражают реализацию компенсаторных механизмов защиты клеток плаценты при гестозе.

Практическая значимость. Среди общепринятых иммунологических тестов отобраны наиболее информативные, позволяющие уточнить раннюю диагностику гестоза, начиная с первого триместра беременности: определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови, оценка функции адгезии мононуклеаров периферической крови к эндотелиальным клеткам, оценка поглощения липидов эндотелиальными клетками и моноцитами.

Разработана модификация метода для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальными клетками линии EA.Hy926 из сыворотки крови. Метод позволяет изучать механизмы, лежащие в основе нарушений липидного обмена, в том числе при гестозе, оценивать риск развития эндотелиальной дисфункции и тяжесть гестоза. Метод также может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Модифицированный метод оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови беременных из аутологичной сыворотки крови позволяет оценить функциональную активность моноцитов и их потенциальную способность образовывать пенистые клетки при гестозе. Метод может быть использован для мониторинга проводимой терапии.

Определение уровня содержания молекул sICAM-1 в сыворотке крови может использоваться в качестве прогностического критерия развития гестоза, а также для оценки выраженности эндотелиальной дисфункции при различных заболеваниях.

Личное участие автора заключалось в проведении всех лабораторных исследований, обобщении и анализе полученных результатов, написании статей. Проведение морфологического и иммуногистохимического анализа осуществлялось при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, анализ содержания липидов в сыворотке крови осуществлялся при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на VII, VIII, IX, X конференциях «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.), конференции «Объединенный иммунологический форум - 2008» (Санкт-Петербург, 2008), 2-м региональном научном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008г.), конференции «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007г.), первом региональном научном форуме «Мать и дитя» (Казань, 2007г), конференции II-го междисциплинарного конгресса «Ребенок, врач, лекарство», (Санкт-Петербург, 2007г.), I съезде патологоанатомов Республики Беларусь (Беларусь, г. Минск, 2006г), конференции «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006 г.), девятой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007 г.), первом международном конгрессе по репродуктивной медицины (Москва, 2006 г.).

По теме диссертации опубликовано 29 работ, в том числе глава в учебнике для

ВУЗ`ов; журнальных статей 14, из них 12 статей в рекомендованных ВАК РФ журналах; 14 тезисов докладов.

Реализация работы. Диссертация выполнена на базе НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН. Результаты исследований внедрены в практическую и научную деятельность лаборатории иммунологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, научную деятельность отдела иммунологии НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН. Материалы диссертации использованы в учебнике для ВУЗ`ов «Руководство по нейроиммуноэндокринологии». Основные положения, материалы и выводы диссертации используются в учебном процессе на кафедре патологии медицинского факультета Государственного образовательного учреждения Высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский Государственный Университет».

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 344 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Текст диссертации иллюстрирован 88 рисунками и 21 таблицей. Список литературы включает 671 источник, из них 75 отечественных и 596 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе работы обследовано 450 женщин во время и вне беременности. В первую группу вошли беременные с гестозом первой и второй степени тяжести без признаков угрожающего прерывания беременности на момент исследования в III триместре беременности. Вторую группу составили беременные на сроке 32-39 недель с физиологическим течением беременности. В третью группу включены здоровые небеременные женщины без признаков воспалительных изменений и гиперлипидемии. Диагноз гестоза у женщин первой группы установлен в Отделении физиологии и патологии беременности НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН на основании ведущих клинических симптомов различной степени выраженности – наличия протеинурии, отеков, гипертензии (повышение систолического давления от 135 мм. рт. ст. и выше, диастолического давления от 85 мм. рт. ст. и выше). При оценке тяжести гестоза использовали классификацию акад. РАМН Г.М. Савельевой, принятую на форуме «Мать и Дитя» в 2005 году. Степень тяжести гестоза оценивали по бальной системе: до 7 баллов – легкая степень тяжести; 8-11 баллов – средняя; 12 и более – тяжелая. Отечественная классификация адекватно сочетается с Международной классификацией болезней Х пересмотра. Группы беременных были сопоставимы по возрасту, паритету родов и акушерскому анамнезу. Периферическую кровь здоровых небеременных женщин получали в отделении переливания крови НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О.Отта СЗО РАМН. Объектом исследования также явились 80 плацент, полученных на разных сроках беременности. Обследованы плаценты, полученные при искусственном аборте у женщин с физиологическим течением беременности (9-11 недель); плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений (38-39 недель); плаценты женщин с течением беременности, осложненным гестозом (38-39 недель). Все плаценты на сроке 38-39 недель получены при родоразрешении путем кесарева сечения. У обследованных женщин оценивали содержание и свойства мононуклеаров периферической крови и содержание иммунологически значимых молекул в сыворотке крови.

Оценка популяционного состава лимфоцитов. Использовали стандартный набор для определения популяций лимфоцитов периферической крови IMKPlus (BD, США), позволяющий определять количество: CD3+ лимфоцитов, CD19+ (B-лимфоцитов), CD3+\CD4+ лимфоцитов, CD3+CD8+ лимфоцитов, CD3+\CD4+\CD8+ лимфоцитов, CD3+\HLA-DR лимфоцитов, CD3–\CD16+\CD56+ натуральных киллеров, CD3+\CD16+\CD56+ NKT лимфоцитов. Гепаринизированную периферическую кровь обрабатывали антителами в соответствии с рекомендациями производителя (BD, США). Учет проводили на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США).

С) в плоскодонном 24-луночном планшете. Затем в часть лунок вносили 100 ЕД/мл рекомбинантного TNF? («Рефнолин», Латвия) и инкубировали 22 часа. Затем отмывали теплым раствором Хенкса. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин. В лунки c монослоем интактных или активированных TNF? клеток линии EA.Hy926 вносили 1*106 мононуклеаров и культивировали 30 минут. Затем отмывали теплым раствором Хенкса от неадгезированных клеток. Адгезированные клетки вместе с монослоем эндотелиальных клеток переводили в суспензию раствором версена. Суспензию клеток обрабатывали моноклональными антителами в комбинациях: анти-VEGF-R1+анти-CD45; анти-CD3(FITC)+анти-CD16+56(PE); анти-CD3(PerCP)+анти-CD4(FITC)+анти-CD8(PE), анти-CD14(FITC) +анти-CD16(PE); контрольными изотип-антителами (BD, США). Анализировали на проточном цитофлуориметре FACSCanto II (BD, США). При анализе в координатах прямого и бокового светорассеяния контролировали наличие эндотелиальных клеток, моноцитов и лимфоцитов в суспензии, полученной после их совместного культивирования. Лимфоциты и моноциты экспрессировали CD45, но обладали низкой экспрессией VEGF-R1. Эндотелиальные клетки экспрессировали VEGF-R1, но не экспрессировали CD45. Затем настройку проточного цитофлюориметра проводили так, чтобы выделить области, занимаемые лимфоцитами и мононуклеарными фагоцитами. Обладающие большими размерами эндотелиальные клетки находились вне пределов выделенных областей. Проводили гейтирование исследуемых клеток в координатах FSC и SSC, анализировали на наличие флюоресценции лимфоциты и моноциты. При анализе данных дополнительно определяли соотношения популяций мононуклеаров периферической крови среди мононуклеаров, адгезировавших к эндотелию. После отсечения зоны дебриса число клеток в популяциях мононуклеаров периферической крови пересчитывали на 100 эндотелиальных клеток.

Определение липидов в сыворотке крови проводили в соответствии с протоколом производителя стандартного набора фирмы Dia Sys (Германия) на автоматическом биохимическом анализаторе Alcyon 300 (Abbot , США). Определение концентрации триглицеридов, липопротеинов высокой плотности, ЛПНП, ЛПОНП, холестерина и оценку индекса атерогенности проводили при консультативной помощи сотрудников лаборатории биохимии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН.

Оценка интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови или эндотелиальными клетками линии EA.Hy926. Метод окраски липидов красителем OIL RED O [Luna, L.G., 1968] модифицировали для оценки интенсивности поглощения липидов моноцитами периферической крови в культуре. Мононуклеары выделяли из периферической крови центрифугированием в градиенте плотности фиколл\верографин и культивировали 3 часа (5% СО2, 37?С) в среде RPMI1640, 10% ЭТС («ICN», США) в лунках стерильного предметного стекла с 4-луночной камерой (3*106 клеток на лунку в 1000 мкл среды). Затем отмывали от неприлипших лимфоцитов теплым раствором Хенкса, и культивировали в 1000 мкл среды 24 часа. Затем из лунок отбирали по 500 мкл среды и добавляли в первую лунку 500 мкл ЭТС (контроль), во вторую лунку с клетками того же пациента 500 мкл аутологичной сыворотки крови (опыт), инкубировали 24 часа.

Для оценки интенсивности поглощения липидов эндотелиальные клетки линии EA.Hy926 помещали в концентрации 8*105 клеток на лунку в 500 мкл культуральной среды на стерильное предметное стекло, снабженное 4-луночной камерой, культивировали 24 часа (5% СО2, 37?С). Затем в лунки вносили 500 мкл сыворотки здоровых небеременных, здоровых беременных или беременных женщин с гестозом. В контрольные лунки вносили 500 мкл ЭТС, инкубировали 24 часа.

После инкубации моноциты или клетки линии EA.Hy926 отмывали теплым раствором Хенкса, фиксировали 10% формалином 10 минут, отмывали дистилированой водой 15 минут. Подготовленные таким образом препараты моноцитов или эндотелиальных клеток промывали 70% изопропанолом 10 минут и окрашивали 0,25% раствором OIL RED O («ICN», США) в 70% изопропаноле 10 минут; промывали дистилированой водой 10 минут; окрашивали гематоксилином 5 минут и промывали дистилированой водой. Препараты фиксировали в глицерин-желатине. Анализировали площадь липидных включений при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 4.0 (Видеотест, Россия). Площадь липидов в каждом поле зрения делили на количество ядер и умножали на 100. Из полученных значений площади липидов в клетках, проинкубированных в присутствии сывороток крови, вычитали значение площади экспрессии липидов, полученное для тех же клеток, но проинкубированных в обычной среде с добавлением 500 мкл ЭТС.

Оценку концентрации растворимых форм мембранных рецепторов в сыворотке крови проводили при помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа: sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1, sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия).

Оценка продукции цитокинов и растворимых форм мембранных рецепторов тканью плаценты. Для иммуногистохимического анализа экспрессии различных факторов экспланты из центральной части плацент фиксировали в 10% формалине. Экспланты из центральной части тех же плацент культивировали в среде DMEM\F12, 10% ЭТС (Sigma, США) 24 часа. Кондиционированные среды собирали и замораживали. Экспланты плацент взвешивали для пересчета концентрации факторов на 1мг ткани. В полученных кондиционированных средах определяли содержание ангиогенина, VEGF, bFGF, IL-8, IP-10, MCP-1, MIG, RANTES, TNF?, IFN?, IL-12p70, IL-1?, IL-2, IL-4, IL-6, IL-5, IL-10 с использованием тест-систем BD Cytometric Bead Array (BD, США) и цитофлюориметра FACSCanto II (BD, США) в соответствии с указаниями производителя. При помощи стандартных наборов для иммуноферментного анализа определяли содержание sICAM-1 (BD, США), sFas, sFasL, sVEGF-R1 и sVE-cadherin (Bender MedSystems, Австрия). Учет результатов проводили на планшетном ридере (Labsystems, Финляндия). Концентрация указанных факторов в среде DMEM\F12, 10% ЭТС не превышала 2 пг/мл.

Иммуногистохимический анализ экспрессии факторов клетками плаценты. Зафиксированные в 10% формалине экспланты из центральной части плацент использовали для иммуногистохимического анализа на серийных срезах экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGF?, TGF?-R, CD105, TSP-1, Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1. Визуализацию проводили с применением универсального набора иммуноглобулинов (Novocastra, UK) и стандартного проявляющего набора (ABC-kit, Novocastra, UK). Для контроля использовали антитела против гемоцианина. Анализ площади экспрессии VEGF, VEGF-R3, bFGF, PDGF, MMP-2, TGF?, TGF?-R, CD105, TSP-1 в ткани плаценты, выраженную в процентах от площади поля зрения, проводили при помощи микроскопа Nikon Eclipse 400 и программы Морфология 5.0. Локализацию апоптоза в ткани плаценты оценивали TUNEL-методом при помощи стандартного набора (Chemicon, США). Анализ площади экспрессии Fas (CD95), FasL (CD95L), TRAIL, каспазы-2, каспазы-3, каспазы-8, каспазы-9 и Mcl-1 в ткани плаценты, проводили при помощи микроскопа Leica DMR и программы Leica QWin. Иммуногистохимический анализ проводился при консультативной помощи сотрудников лаборатории патоморфологии НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отта СЗО РАМН, за что автор выражает благодарность д.м.н., профессору Кветному И.М., к.м.н. Колобову А.В. и Соповой Е.С.

Статистический анализ проводили при помощи критерия Манна-Уитни, медианного теста, используемого для определения тенденции изменения признака [Makhseed M., 2001], и корреляционного анализа Спирмена в программе STATISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Секреция и экспрессия тканью плаценты на разных сроках беременности факторов, контролирующих ее развитие. При морфологическом исследовании плацент на сроках 9-11 недель и 38-39 недель при физиологически протекающей беременности отмечали нормальное строение ткани. При гестозе на сроке 38-39 недель в плацентах отмечали нарушение формирования и ветвления ворсин, инволютивно-дистрофические изменения, мононуклеарные инфильтраты с преобладанием лимфоцитов. Для оценки влияния различных факторов на формирование ткани плаценты в норме и при гестозе оценивали их секрецию и экспрессию клетками плаценты.

Таблица 1. Секреция тканью плаценты bFGF.

Цитокины Группы Концентрация в пикограммах в 1мл кондиционированной среды Концентрация в пикограммах в пересчете на 1мг ткани

bFGF 9-11 недель (n=15) 1309,3±239,1* 12,7±1,7**

38-39 недель (n=30) 655,3±76,5 5,9±0,5

гестоз, 38-39 недель (n=35) 545,4±22,4?? 5,6±0,3???

Достоверность различий между группами: группа «9-11 недель» отличается от группы «38-39 недель» * – р<0,05; ** – р<0,01; группа «гестоз, 38-39 недель» отличается от группы «9-11 недель» ?? – р<0,01; ??? – p<0,001.

Секреция bFGF тканью плаценты на сроке 9-11 недель была в два раза выше, чем на сроке 38-39 недель (Таблица 1). Экспрессия bFGF в ткани плаценты на ранних и поздних сроках беременности не различалась (Таблица 2). Статистически значимых различий между уровнями секреции bFGF на сроке 38-39 недель и при гестозе не обнаружено. При гестозе выявлена статистически недостоверная тенденция к снижению секреции bFGF тканью плаценты. В тоже время, экспрессия bFGF клетками плацент беременных с гестозом была достоверно ниже (Таблица 2), чем клетками плацент здоровых беременных на сроке 38-39 недель, что подтверждает данные, полученные нами при анализе секреции bFGF тканью плацент и отражает нарушение процессов ангиогенеза.

Ангиогенин обнаружен в высоких концентрациях как при физиологической беременности, так и при гестозе. Статистически значимых различий в секреции ангиогенина между группами не выявлено, однако медианный тест показал тенденцию к повышению секреции ангиогенина клетками плаценты к третьему триместру физиологически протекающей беременности и в большей степени при гестозе (Рисунок 1).


загрузка...