Исследование роли парамагнитных интермедиатов в биологически важных процессах в растворах и организованных средах (13.07.2009)

Автор: Поляков Николай Эдуардович

В результате, варьируя время (, мы получим зависимость концентрации РП от времени отражающую только кинетику образования радикальных пар. Импульсная последовательность 3 позволяет детектировать только те РП, время жизни которых превышает время (. В результате получается спадающая кинетическая кривая с характерным временем спада отражающем время жизни РП и релаксационные процессы (Рис. 7). Кинетические параметры РП, полученные в данной работе суммированы в Таблице 1.

kp kESC kH

AQ/SDS 11.8 0.2 6.0

AQSO3-/SDS 45.0 3.0 6.0

XLI 10 0.2 10

XLII 6.5 0.2 1.0

XLIII 7.0 0.2 3.7

Таблица 1. Кинетические параметры радикальных пар. Константы скорости даны в единицах 106 с-1.

Рисунок 7. Зависимости сигнала PYESR от времени для трех импульсных последовательностей (см. Рис. 5.), зарегистрированные при фотовосстановлении антрахинона (а) и антрахинон-2-сульфоната (b) в мицелле SDS (0.2 M). Концентрация спиновой ловушки 1 мМ. Лазерное облучение проводилось в течение 20 с. на длине волны 335 нм. Расчетные кривые представлены прерывистой линией (ИП-1), сплошной линией (ИП-2) и пунктиром (ИП-3).

Эксперименты по лазерному импульсному фотолизу ацетиленовых кетонов позволили измерить времена жизни триплетных состояний кетонов и соответствующих кетильных радикалов, а также зарегистрировать значительный магнитный эффект на времена жизни кетильных радикалов (Рис.8 и Таблица 2).

Отметим, что магнитный эффект не наблюдается на времена жизни триплетных состояний кетонов, поскольку их образование не включает магнито-чувствительных стадий.

Рисунок 8. Кинетика спада промежуточного поглощения при фотолизе кетона XVI в мицеллярном растворе. Слева – кетильного радикала (? = 370 нм) в отсутствие (a) и в присутствие (b) магнитного поля (150 мТл), справа – триплетного состояния (? = 550 нм) (зависимость от магнитного поля отсутствует).

Таблица 2. Времена жизни возбужденного триплетного состояния и кетильного радикала кетонов XLI-XLII в мицеллярных растворах SDS и Brij 35 измеренные по спектрам промежуточного поглощения на длинах волн 550 и 370 нм. Времена жизни приведены в наносекундах. (*) не измерялась из-за перекрывания сигналов продуктов.

кетон XLI XLII

мицелла ?T ?К

(H=0) ?К

(H=150 мТл) ?T ?К (H=0) ?К

(H=150 мТл)

SDS 91 440 2800 1460 * 2420

Brij 35 <5 950 3800 56 1130 3100

Приведенные в данной главе примеры использования метода PYESR с временным разрешением демонстрируют уникальные возможности данного метода для получения кинетической информации о динамике радикальных пар в растворах. Полученные данные о структуре радикальных пар и о кинетике процесса фотовосстановления ряда карбонильных соединений хорошо согласуются с данными полученными другими методами, в частности, методами ХПЯ и лазерного импульсного фотолиза. Отметим, что использование в исследовании комбинации различных кинетических методов существенно повышает объем и достоверность полученной информации. В последующие годы этот метод успешно применялся нашими японскими коллегами для исследования бирадикалов, а также радикальных пар в других средах с ограниченной подвижностью, в частности, в нанопорах (M. Okazaki, et al., Phys. Chem. Chem. Phys., 2002, 4, 1201-1205).

В контексте исследования природы влияния организованной среды на реакционную способность химических соединений, наиболее важными являются следующие наблюдения. Это существенные изменения времен жизни РП и вероятностей клеточной рекомбинации свободных радикалов в мицеллах по сравнению с гомогенным раствором, а также зависимость динамики партнеров РП от параметров самой мицеллы. Эти наблюдения содержат указания на возможные причины изменений в механизмах и направлении реакций для многостадийных радикальных процессов в организованных средах. Исследованию таких процессов с участием биологически важных соединений методом ХПЯ, а также другими физическими методами посвящена следующая глава диссертации.

В Главе 7 представлены два цикла работ посвященных исследованию комплексов включения ряда лекарственных препаратов и каротиноидов. В первой части рассматривается важная проблема, имеющая отношение к практическому применению каротиноидов в качестве антиоксидантов. Это - комплексообразование каротиноидов и влияние организованной среды на их реакционную способность в окислительно–восстановительных процессах. Известно, что такие свойства каротиноидов, как гидрофобность, высокая фоточувствительность и химическая активность, существенно затрудняют их применение на практике. Одним из путей решения подобных проблем в фармакологии является использование комплексов включения типа «гость-хозяин». Молекулы «гостя» в комплексе могут менять свои физические, и химические свойства, а также биодоступность и стабильность. На первом этапе методами ЯМР, ЭПР и оптической спектроскопии были исследованы комплексы включения каротиноидов и их структурного аналога (-ионона с циклодекстринами. Показано, что комплексы каротиноидов с циклодекстринами образуют агрегаты в водных растворах, обладают повышенной фотостабильностью, однако теряют способность захватывать свободные радикалы. Интересной находкой в этом плане явилось использование в качестве молекулы «хозяина» (-глицирризиновой кислоты (ГК) - природного соединения принадлежащего к тритерпеновым гликозидам. Впервые показано, что ГК образует комплексы с каротиноидами не только в водных растворах, но и в ряде органических растворителей (ДМСО, ацетонитрил, спирты). В частности, по изменению интенсивности флюоресценции кантаксантина в ДМСО была оценена константа стабильности комплекса между молекулой кантаксантина и димером ГК (Рис. 9).

Рисунок 9. (а) Спектр флюоресценции раствора кантаксантина, 0.02 мМ в отсутствие и в присутствие глицирризиновой кислоты (ГК) в ДМСО содержащем 5% воды. Длина волны возбуждения 470 нм, регистрации – 620 нм. (b) Зависимость изменения интенсивности флюоресценции каротиноида от концентрации ГК в растворе.

Из рисунка видно, что ход кривой отличается для диапазона концентраций 0.01 – 1 мМ и > 1 мМ. На момент выполнения настоящей работы, кроме вышеописанных комплексов состава 2:1 были описаны мицеллы глицирризиновой кислоты, образующиеся в растворах с концентрацией более 1 мМ.

В работе показано, что комплексообразование с глицирризиновой кислотой оказывает заметное воздействие на реакционную способность каротиноидов. Было зарегистрировано уменьшение скоростей переноса электрона в реакции с акцепторами, а также удлинение времени жизни катион-радикалов каротиноидов в комплексах, приводящее к изменению соотношения продуктов реакции. На Рис. 10 приведен пример изменения кинетики спада сигнала поглощения катион-радикала (-каротина в реакции с дихлор-дициан-бензохиноном (ДДХ) в присутствие ГК.

Рисунок 10. Кинетики спада сигнала поглощения катион-радикала (-каротина на 935 нм в отсутствие и в присутствие ГК. Концентрации (-каротина и ДДХ равны 4 (М.

В отличие от комплексов с циклодекстринами, экспериментально обнаружено многократное (в десятки раз) увеличение скорости захвата перекисных радикалов (антиоксидантная активность) каротиноидами в комплексе с ГК (Рис. 11), и установлено, что причина этого явления кроется во влиянии комплексообразования на окислительные потенциалы каротиноидов.

Следует отметить, что, несмотря на большой интерес к использованию комплексов включения с целью направленного изменения свойств включенных соединений, до сих пор остается открытым вопрос о природе влияния комплексообразования на их реакционную способность. Представленные в настоящей главе результаты исследований процессов одноэлектронного переноса с участием комплексов каротиноидов являются практически единственной попыткой приблизиться к решению этого вопроса.

Рисунок 11. Спектры ЭПР аддукта PBN-OOH в отсутствие (вверху) и в присутствие кантаксантина и его комплекса с ГК в ДМСО. [PBN] = 5 мМ, [FeCl2] = 1 мМ, [H2O2] = 0.5 M.

В Главе 7 представлен также цикл работ, посвященных исследованию комплексов включения нифедипина и лаппаконитина с глицирризиновой кислотой, в частности, влияния комплексообразования на реакционную способность этих соединений. Используя оптическую и ЯМР спектроскопию (включая релаксационные методы) нам удалось показать, что глицирризиновая кислота образует очень стабильные комплексы как с нифедипином, так и с лаппаконитином (константа стабильности порядка 105 М-1, что на два порядка превышает типичное значение для комплексов циклодекстринов). В частности для нифедипина образование комплекса было доказано по изменению его растворимости в присутствие ГК (Рис. 12), а также по изменению времени фазовой релаксации Т2 (Рис. 13). Следует отметить, что в экспериментах на животных с участием автора диссертации было обнаружено значительное (в сотни раз) усиление терапевтической активности нифедипина в присутствие ГК.

Рисунок 12. Диаграмма растворимости нифедипина как функция концентрации ГК в 5% метанольном растворе в воде.

Рисунок 13. Кинетики спада сигнала эха метильных протонов НФ в чистом метаноле (1), в метаноле в присутствие 0.7 мМ ГК (2), и в 30% метанольном растворе в присутствие 0.7 мМ ГК (3).

В работе также продемонстрировано, что комплексообразование с ГК существенно снижает скорость фотодеградации нифедипина и лаппаконитина, приводящей к образованию активных свободных радикалов. Данный результат может иметь практическое значение при использовании комплексообразования для увеличения фотостабильности этих, а также других лекарственных препаратов, для увеличения их биодоступности и снижения токсичности (включая фото-токсичность).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

I. В первой части работы, в результате исследования строения и свойств радикальных интермедиатов в растворах, установлены детальные механизмы ряда биологически значимых процессов:

Продемонстрировано, что фотоинициированное окисление акцепторами электрона синтетических аналогов NADH - 1,4-дигидропиридинов (ДГП) проходит по радикальному пути с образованием тех же продуктов, которые получаются и в реакциях смешения: соответствующих пиридинов или катионов пиридиния.

На примере широкого набора полиненасыщенных соединений получены экспериментальные доказательства участия короткоживущих парамагнитных частиц в реакциях фотоинициированной цис-транс изомеризации.

Продемонстрировано, что скорости реакций перекисных радикалов с каротиноидами с коррелируют с их окислительными потенциалами. Это прямо указывает на связь антиоксидантной активности каротиноидов с процессом переноса электрона. Установлено, что каротиноиды могут проявлять как антиоксидантные, так и про-оксидантные свойства, и определена роль ионов металлов в этих процессах.

Показано, что при фотолизе лекарственных препаратов нифедипина и лаппаконитина в растворах образуются активные короткоживущие парамагнитные интермедиаты: бирадикалы, ион-радикалы и нейтральные радикалы, могущие быть причиной фототоксических побочных эффектов, возникающих при медицинском применении этих препаратов.


загрузка...