Гемоглобины человека: иммунобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение (12.10.2009)

Автор: Кривенцев Юрий Алексеевич

Моновалентные антисыворотки на изучаемые типы гемоглобина получали самостоятельно методом иммунизации кроликов породы «шиншилл» дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. При моделировании иммунохимических тест-систем применяли: выделение ?-цепей пара-хлормеркурибензоатом, истощение антисывороток путем иммуноаффинной хроматографии на Bio Gel P-200, электрофорез в агаре, иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу (Grabar P. et al. 1958).

Для индикации белков в био- и клиническом материале использовали:

оптические методы определения: унифицированный гемоглобинцианидный метод (по инструкции Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000), определение фетального гемоглобина по Зингеру в модификации Бетке (Betke, K. 1979); определение общего белка биуретовым методом (набор реагентов фирмы «Vital», экстинкцию измеряли на фотоэлектроколориметре «Spicol-11») или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу.

иммунохимические методы: иммунодиффузионное титрование по Ouchterlony в модификации Н.И.Храмковой и Г.И.Абелева, РИД по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви (Fahey, J.L. 1965), ракетный электрофорез в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D в авторской модификации.

Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (?), среднюю ошибки средней арифметической (m). Проводили дисперсионный анализ с подсчетом степеней свободы (?меж и ?вну) и критерия дисперсии (F). С целью определения значимости Р различий сопоставляемых величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различие считали достоверным при Р<0,05. Для оценки межгрупповой зависимости проводился линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - r). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины r к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999).

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительное изучение физико-химических свойств основных типов гемоглобина (HbA1, HbA2, HbF и HbP) показало, что все изучаемые типы являются водорастворимыми хромопротеидами с электрофоретической подвижностью ?-глобулинов. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки Hb от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина. Показаны значительные отличия разных типов гемоглобина в способности осаждаться сульфатом аммония, что может быть использовано при их разделении. Установлено, что HbP резистентен к действию щелочей, но его устойчивость ниже, чем у HbF (табл. 4).

Экспериментально показано, что из четырех основных типов гемоглобина, как в ПААГ, так и в агарозном гелях максимальную электрофоретическую подвижность (как по альбумину, так и по гемоглобину А1) имеет эмбриональный гемоглобин, второй по скорости миграции - HbA1. В агарозном геле минимальную подвижность среди названных протеинов имеет HbA2, а в ПААГ – HbF (рис. 1). Степень корреляции относительной электрофоретической подвижности изучаемых протеинов, как по альбумину, так и по гемоглобину А1, оказалась положительной и высокой (в агарозе: r = 0,88; в ПААГ: r = 0,91).

Таблица 4

Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов

Ф/х свойства HbA1 HbA2 HbF HbP

Растворимость в воде + + + +

Отношение к осаждающим реагентам

0,5% риванол

этанол

осаждается обратимо***

осаждается обратимо***

осаждается обратимо***

осаждается обратимо***

осаждается обратимо*** осаждается обратимо***

осаждается обратимо*** осаждается обратимо***

Отнощение к сульфату аммония (в % насыщенности):

оптимум осаждения

диапазон осаждения

30-65*

30-65*

40-80*

Относительная электрофоретическая подвижность по альбумину:

в агарозе

в ПААГ

0,258±0,009*

0,29-0,30**

0,610±0,022*

0,63-0,68**

0,206±0,007*

0,537±0,020*

0,51-0,525**

0,217±0,008*

0,30-0,35**

0,512±0,019*


загрузка...