Научно-организационные основы эпидемиологического надзора  за природно-очаговыми и  особо опасными вирусными инфекциями  в Восточной Сибири (12.10.2009)

Автор: Андаев Евгений Иванович

Примечание: КК – культура клеток; НБМ – новорожденные белые мыши

протяжении трех пассажей, т.е. все они имеют селективное преимущество при размножении в клеточной культуре. Отрицательный результат получен и при переводе штаммов с 28 на 37 °С (табл. 5).

При смене системы культивирования с культуры клеток на НБМ положительный результат получен у 16 из 37 (43,2 %) ИФА-положительных и у семи из 24 (29,1 %) ИФА-отрицательных изолятов. Причем, при смене систем культивирования с культуры клеток на НБМ больше положительных результатов получено для штаммов, изолированных при 37 °С, чем при 28 °С.

За 1995-1998 гг. изучения очагов клещевого энцефалита в Иркутском, Ольхонском, Слюдянском и Эхирит-Булагатском районах Иркутской области нами выделено 130 штаммов от иксодовых клещей: /. persulcatus (123), D. silvarum (2) и D. nuttalli (5). У 25 штаммов изучена вирулентность вируса для беспородных белых мышей при внутримозговом и подкожном способах введения материала. При внутримозговом заражении показатели вирулентности варьировали в пределах 5,09-10,0 lg ЛД 50/мл и подкожном - 3,60-9,16 lg ЛД 50/мл (титр 3,60 lg ЛД 50/мл выявлен только у одного штамм при внутримозговом заражении, титр 5,09 lg ЛД 50/мл - у одного штамма при подкожном заражении). Индекс инвазивности (ИИ) – в пределах 0,13-3,0 При экстраневральном введении высокая вирулентность (выше 8,0 lg ЛД 50/мл) выявлена у 10 штаммов. ИИ у них находился в пределах 0,15-1,5 lg ЛД 50/мл - Средние величины титров при церебральном заражении составили 8,12 ± 0,23, при периферическом - 7,34 ± 0,28 lg ЛД 50/мл. Средний показатель ИИ = 0,77 ± 0,15. Таким образом, большинство (92 %) изученных штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ <2,0), один штамм оказался умеренно вирулентным (ИИ = 3,06). Штаммы обладали выраженной гетерогенной гемагглютинирующей активностью, вызывая агглютинацию гусиных эритроцитов в условиях оптимума рН 6,2 при 4 °С в пределах 1:20-1:640.

Свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей, умерших от клещевого энцефалита (на примере Забайкальского края, 1995-2003 гг.). Для изучения этиологической структуры очаговых форм КЭ, заканчивающихся летальным исходом, в Забайкальском крае впервые с применением молекулярно-биологических методов изучена представительная группа штаммов вируса КЭ, выделенных от 13 умерших людей с энцефаломиелитической, менингоэнцефаломиелитической, менингополиомиелитической формами КЭ. Штаммы изолированы на НБМ, зараженных пробами из разных отделов головного (11), спинного (1) мозга и трупной крови (1). Результаты изучения вирулентности для беспородных белых мышей массой 6-8 г показали, что большинство штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ<2,0) и только один штамм (653) – умеренновирулентный (ИИ = 3,0). Различия в способности преодолевать гематоэнцефалитичесий барьер у изученных штаммов разных подтипов вируса КЭ не установлены. Штаммы независимо от подтиповой принадлежности агглютинировали эритроциты гуся в зоне рН 5,8-6,2. Титры гемагглютинина колебались от 1:40 до 1:1280. Преобладали штаммы со средними титрами. Исключение составил штамм 102 (дальневосточный подтип), у которого отсутствовали гемагглютинирующие свойства. Это один из немногочисленных антигенно-дефектных изолятов вируса КЭ, с которыми связывают развитие серонегативных форм инфекции (Погодина В.В. и др., 1992). Все изученные штаммы проявляли цитопатическое действие на культуре клеток СПЭВ, но в то же время различались по срокам деструкции монослоя и степени его выраженности.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита. Нами охарактеризована структура вирусной популяции в Приангарье по результатам ретроспективного генотипирования 47 изолятов вируса КЭ, выделенных в 1995-2005 гг. из клещей, собранных на территории Иркутского (46) и Ольхонского (1 изолят) районов Приангарья и 1 штамма, выделенного из пробы головного мозга от больной К., умершей от КЭ (Иркутская область). Генотипирование штаммов методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с генотипоспецифическими зондами показало абсолютное преобладание сибирского подтипа: из 47 изолятов 41 (87,2 %) принадлежит к сибирскому, два (4,2 %) – к дальневосточному подтипам и четыре (8,5 %) содержат смесь вирусов двух генотипов в различной концентрации – микст-штаммы (табл. 6).

Таблица 6

Результаты генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных из иксодовых клещей, собранных на территории Приангарья в 1995-2005 гг.

Место сбора клещей Год Количество генотипированных штаммов Генотип

сибирский дальне-

восточный микст

Байкальский тракт 1995 20 17 1 2

1996 2 2 - -

1997 4 2 1 1

1998 2 2 - -

2005 9 9 - -

Тихонова падь 1995 2 2 -

Голоустненский тракт 1995 2 2 - -

1997 1 1 - -

Утулик 1996 3 3 - -

107 км. КБЖД 1995 1 1 - -

Ольхонский район 1995 1 - - 1

Всего (%) 47 41 (87,2 ) 2 (4,2) 4 (8,5)

Полученные сведения являются новыми доказательствами ранее описанного (Верхозина М.М. и др., 2007) преимущественного распространения в Приангарье сибирского подтипа вируса КЭ.

В Забайкальском крае от больных, умерших от очаговых форм КЭ, изолировано 13 штаммов вируса. Генотипированием установлено наличие среди них штаммов вируса КЭ дальневосточного (8 штаммов) и сибирского (4 штамма) подтипов. Один штамм (штамм 29) охарактеризован как микст - содержал участки генома дальневосточного и сибирского подтипов. В результате впервые проведенного комплексного изучения биологических, в том числе и молекулярно-генетических свойств штаммов вируса КЭ, выделенных от умерших больных показано, что в Забайкальском крае заболевания КЭ обусловлены двумя самостоятельными подтипами вируса – дальневосточным и сибирским. Оба подтипа вызывают развитие очаговых форм болезни с летальным исходом. Очаговые формы связаны и с микст-штаммами вируса КЭ.

Таким образом, на основе генотипирования 61 штамма охарактеризована структура популяции вируса КЭ, циркулирующего в Приангарье и Забайкалье в 1995-2005 гг. Структура популяции сформирована на основе сибирского и дальневосточного генотипов с абсолютным доминированием сибирского генотипа (87 %) в Приангарье (Иркутский район) и напротив, доминированием в Забайкалье дальневосточного генотипа (61,5 %). Показано, что в очаге совместной циркуляции разных подтипов появляются микст-штаммы вируса КЭ, в которых сочетаются генетические признаки сибирского и дальневосточного подтипов; впервые в природном очаге в Приангарье изолированы четыре таких штамма, а в Забайкалье – один.

Совершенствование лабораторной диагностики природно-

очаговых и особо опасных вирусных инфекций

Вирусологический мониторинг природного очага вируса клещевого энцефалита на основе комплексного применения методов первичной изоляции вируса из иксодовых клещей. Для повышения эффективности эпидемиологического надзора нами разработан алгоритм вирусологического мониторинга природных очагов КЭ, основанный на комплексном использовании биологической изоляции (лабораторные животные, культура клеток), серологических (ИФА, МФА) и молекулярно-генетических методов с целью выявления наиболее широкого спектра циркулирующих в природном очаге вариантов вируса и оценки их эпидемиологической значимости. Такой подход отличается от применяемых другими исследователями, во-первых, исследованием как положительных, так и отрицательных в ИФА клещей, во-вторых, заражением клеточной культуры одновременно при двух температурных режимах (рис. 3.).

Из 3057 исследованных в ИФА клещей положительный результат получен в 165 пробах, что составило 5,4 ± 0,4 %. Из них в соответствии с применяемыми методами получено семь групп изолятов (табл. 7). Параллельно на НБМ и в КК удалось выделить 22,0 %, в КК - 50,0 % и на НБМ - 27,9 % изолятов. При заражении КК получено в 1,8 раз больше изолятов, чем на НБМ, причем на КК при 37 оС их выделено несколько больше, чем при 28 оС. Получен только один изолят одновременно на НБМ и в КК при двух температурных режимах. Следует отметить, что не из всех антигенсодержащих клещей удалось выделить вирус КЭ. Из 165 положительных в ИФА суспензий методами биологической пробы в различных системах изоляции выделено только 68 патогенных агентов (41,2 ± 3,8 %).

Рис. 3. Схема изоляции и типирования вируса клещевого энцефалита из клещей Ixodes persulcatus на основе комплексного применения методов первичной изоляции. Примечание: * - отрицательные в ИФА суспензии клещей объединены по 5-10 в пулы; НБМ – новорожденные белые мыши; КК – культура клеток

Таблица 7

Общее количество патогенных агентов (изолятов), выделенных в различных системах первичной изоляции из положительных и отрицательных в иммуноферментном анализе клещей Ixodes persulcatus

Система первичной

изоляции Количество выделенных патогенных агентов из:

ИФА-положительных клещей (n=165) ИФА-отрицательных

клещей (n=382)

НБМ и КК при 37 и 28 оС 1 (1,5 %) 1 (1,6 %)

НБМ и КК при 37 оС 9 (13,2 %) 4 (6,4 %)

НБМ и КК при 28 оС 5 (7,3 %) 3 (4,8 %)


загрузка...