РАЗРАБОТКА ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ПРОТИВОМЕЛАНОМНОЙ ВАКЦИНЫ (12.09.2012)

Автор: Михайлова Татьяна Витальевна

Клетки культивировали в среде RPMI 1540, содержащей 10% телячьей эмбриональной сыворотки, 2мМ L-глутамина, 1% HEPES, пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкг/мл), комплекс аминокислот и витаминов (Flow Lab) в культуральных флаконах (Costar).

1.2.Получение опухолевого лизата

Для получения опухолевого лизата наращивали по 10 млн. клеток линий MelP, MelKor, MelMtp, MeIl, MelIs, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, MelIbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Клетки ресуспендировали в среде и переносили в ампулы для криоконсервации. После этого клетки замораживали и размораживали, соответственно помещая ампулы вначале в жидкий азот, а потом в водяную баню (370С); процедуру повторяли пять-шесть раз. Затем поврежденные клетки осаждали центрифугированием при 3000g в течение 10 минут. Определяли концентрацию белка, разливали на аликвоты и хранили при –20oС.

1.3.Определение концентрации белка в опухолевом лизате

Определение концентрации белка проводили на спектрофотометре Beckman Coulter (США) при 260 нм и 280 нм, а также модифицированным методом Лоури с бицинхониновой кислотой. Использовали набор BCA Protein Assay Reagent Kit 23227 фирмы Pierce. Для проведения анализа готовили необходимое количество рабочего раствора — смешением растворов А и В в объемном соотношении 50:1. Если измерения проводили в больших (4 мл) кюветах спектрофотометра, то следующие манипуляции проводили в подходящих пробирках: смешивали 0,1 мл анализируемой пробы с 2 мл рабочего раствора, смесь инкубировали 30 минут при температуре 37°С и фотометрировали при 562 нм.

2. Методы идентификации и количественного определения Hsp70

Определяли уровень Hsp70 на клетках линий меланомы человека MelP, MelKor, MelMtp, MeIl, MelIs, MelSi, MelMe, MelGus, MelZ, MelGi, MelIbr, MelR, MelRac, MelCh, MelCher. Первая опытная группа клеток – интактные клетки. Вторая опытная группа – клетки, прогретые при 42 ?С в течение 10 мин на водяной бане, после чего помещенные в СО2-инкубатор на 30 мин. Третья опытная группа – клетки, предварительно замороженные при -800 С.

2.1. ДСН – электрофорез в полиакриламидном геле

Электрофорез лизата клеток меланомы проводили по методике, предложенной Лэммли в камере Mini-PROTEAN («Bio-Rad», США).

2.2. Определение уровня Hsp70 методом иммуноблот

Нитроцеллюлозную мембрану с перенесенными белками инкубировали при комнатной температуре в течение часа с 5% раствором сухого молока Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk (Bio-Rad) для блокирования неспецифического связывания в буфере А, состоящем из 2М трис, 0,5 М ЭДТА, 5М NaCl, 0,1 % реагент Tween 20 (Bio-Rad). Затем мембрану дважды отмывали в 20 мл буфера А по 10 мин. Далее проводили инкубацию с антителами Mouse anti-heat shock Protein 70 Monoclonal Ig G (Abfrontier), разведенными в соотношении 1: 2000 в буфере А в течение 90 мин. После этого мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.

Инкубацию с антителами Blotting Grade Affinity Purified Goat Anti Mouse Ig G Alkaline Phosphatase conjugate (Bio-Rad), разведенными в соотношении 1:3000 в буфере А, проводили в течение 90 мин. Затем мембрану отмывали дважды по 15 мин в буфере А.

Мембрану детектировали с помощью красителя 1 Step NBT/BCIP (Thermo scientific). Результат и степень интенсивности окраски полос фиксировали на анализаторе Syngene с помощью программы Gene tools.

3. Методы получения и изучения физико-химических свойств липосом с

лизатом клеточных линий меланомы

3.1. Получение многослойных липосом

Многослойные липосомы готовили следующим образом: навески лецитина и холестерина (мольное соотношение компонентов 3:1) растворяли в небольшом объеме хлороформа. Для предотвращения окисления липидов добавляли антиоксидант – а-токоферола ацетат в количестве 0,01% от общего количества липидов. Полученную смесь липидов выдерживали, периодически помешивая, до полного растворения липидов. Растворитель отгоняли в вакууме водоструйного насоса (4±2 мм рт.ст.) на роторном испарителе, при температуре бани + 40°С. После полного удаления органического растворителя на стенках колбы образовывалась тонкая пленка фосфолипидов.

В качестве криопротектора использовали сахарозу в концентрации 10% от общего количества липидов. Для этого сахарозу растворяли в изотоническом растворе. Затем к раствору сахарозы прибавляли клеточный лизат в различных соотношениях лизат : липиды (1 : 108, 1 : 217 по весу). После чего липидную пленку смывали этим раствором при температуре 38°С до образования белой эмульсии (дисперсия многослойных липосом). Включение лизата проходило по принципу пассивной загрузки.

3.2. Определение размера липосом методом оптической микроскопии

Размеры липосом определяли методом оптической микроскопии с помощью интерференционно – поляризационного микроскопа иммерсионным методом. Использовали оптический микроскоп МРI-3, увеличение х20.

Пробу для микроскопирования готовили путем тщательного диспергирования 5 мг препарата в 5 мг инертной дисперсионной среды. В качестве дисперсионной среды использовали вазелиновое масло.

Каплю полученной суспензии наносили на предметное стекло пипеткой. Измеряли и изучали не менее 200 частиц, если частицы различались по размерам в несколько десятков раз, и 1000 частиц при большей полидисперсности образца. Размер частиц не превышал 100 мкм.

3.3.Определение структуры липосом методом электронной микроскопии

Регидратированные в дистиллированной воде образцы липосомальной лекарственной формы противомеланомной вакцины (ЛЛФПВ) смешивали 1:1 с 1,5% раствором глютарового альдегида в фосфатном буфере. После 30 мин фиксации при 40С препараты в количестве 5 мл центрифугировали 1 час при 30 000 об/мин на ультрацентрифуге L-8 Beckman. Осадок дважды отмывали от фиксатора дистиллированной водой и проводили постфиксацию 2,5% раствором тетраоксида осмия в фосфатном буфере. Препараты обезвоживали окисью пропилена и этанолом в возрастающих концентрациях и заливали в эпоскидную смолу (смесь эпон/аралдит). Ультратонкие срезы, полученные на ультрамикротоме Ultracut (Reichert, Austria), окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца.

Препараты просматривали на просвечивающем электронном микроскопе JEM-IOOS фирмы JEOL (Япония) при инструментальном увеличении 10 000 – 50 000.

3.4. Определение эффективности включения лизата в липосомы

Определение процента включения белка в липосомы проводили методом спектрофотометрии при длине волны 260 нм и 280 нм. Разделение липосом с лизатом от не включившихся белков проводили ультрацентрифугированием при 50 тыс. об/мин в течение 15 мин. Супернатант, содержащий не включившийся антиген, декантировали, а осадок липосом ресуспендировали в физиологическом растворе NaCl 0,9% и снова центрифугировали. Процесс промывания липосом повторяли до удаления остаточного количества белка в супернатанте, содержание которого контролировали на спектрофотометре. После последнего центрифугирования осадок липосом суспендировали в требуемом объеме физиологического раствора NaCl 0,9%, после чего разрушали 5% раствором Тритона Х-100.

Эффективность включения белка (В, %) рассчитывали по формуле:

B=(С ( 100%)/Сисх,

где С – концентрация белка, определенная после разрушения липосом;

Сисх – концентрация белка при включении в липосомы.

3.5. Определение степени окисления липидных компонентов.

Степень окисления липидных компонентов определяли по количеству продуктов деградации лецитина с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК).

Для определения ТБК-активных продуктов в образцах 1 мл дисперсии липосом переносили в пробирку с притертой пробкой, добавляли 1 мл буферного раствора (0,15М КСl и 10мМ Трис-HCl) 0,5 мл 30% трихлоруксусной кислоты и 1 мл 0,67%-ного водного раствора ТБК. Полученную смесь интенсивно встряхивали и нагревали на водяной бане в течение 30 минут при температуре 80°С, затем охлаждали в токе холодной воды до комнатной температуры и центрифугировали 10 мин при ( = 3000 об/мин (225g). Полученный раствор переливали из пробирки в кварцевую кювету и измеряли оптическую плотность на длине волны 532 нм и 550 нм относительно контрольного опыта (дистиллированной воды). Концентрацию ТБК-активных продуктов определяли по формуле:

С = ((OD * V() / ( * l * Vпр,

где (OD – разность оптических плотностей раствора на длинах волн 532 и 550 нм; V(, Vпр – суммарный объем и объем пробы соответственно;

( –коэффициент экстинции 1,56*105 л/(моль см); l – оптический путь, мм.

4. Оценка изменений числа ифн- ?- продуцирующих лимфоцитов в ответ на

стимуляцию ЛЛФПВ in vitro

Незрелые ДК получали путем культивации адгезивных моноцитов периферической крови здоровых доноров. Неадгезивные лейкоциты (обогащенную лимфоцитарную фракцию) замораживали для последующих экспериментов. Индукцию терминальной дифференцировки части ДК вызывали с помощью инкубации в присутствии цитокинового коктейля. Часть зрелых ДК нагружали опухолевым лизатом линий Mel Si, Mel Mtp, Mel Z, Mel Is, Mel Kor. Другую часть зрелых ДК сливали с липосомальным лизатом.


загрузка...