Эффекты кластеризации глобулярных белков в растворах (12.07.2010)

Автор: Рожков Сергей Павлович

САЧ, САЧ-СМ – сывороточный альбумин человека и его спин-меченый аналог;

L-L, L-S –фазовые переходы (ФП) типа жидкость-жидкость, жидкость-твердое тело.

ДЛФО – теория устойчивости коллоидов Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека;

ЭПР-электронный парамагнитный резонанс,

ВБМ – водно-белковая матрица, ПЭГ – полиэтиленгликоль; ФД – фазовая диаграмма;

НКТР, ВКТР – нижняя и верхняя критические температуры растворения;

С60FWS – водорастворимый фуллерен, ShC – шунгитовый углерод; ND- наноалмаз;

HbS, HbA, HbС – формы гемоглобина

Рис.1 Зависимости экспериментальных значений частоты вращения 1/(c метки Maleimido-TEMPO, модифицирующей молекулы САЧ, от молярной концентрации NaCl (m3) при разных температурах. Белок в 0,001 М фосфатном буфере, рН 7,3.

Концентрация белка 50 мг/мл

Рис.2 Спектры ЭПР спин-меченого САЧ: а) 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,3 + 0,15 М NaCl, 20 0С. А и В указывают положение компонент, соответствующих сильной (А) и слабой (В) иммобилизации метки в водно-белковой матрице; I0A, ((H0)2A , I0B, ((H0)2B – экспериментальные параметры для расчета эффективного распределения спин-метки между (А) и (В) состояниями.

б) Температура 77 К, полная иммобилизация метки.. Отношение d1/d зависит от диполь-дипольного взаимодействия меток и используется для оценки среднего расстояния между молекулами белка.

Рис.3 Эффективные значения свободной энергии ((2Tr переноса белка из бессолевой в солевую среду: (1,2,4) – NaCl; (3) – CaCl2. Концентрация белка: (3) – 110 мг/мл в 0.01 М ацетатном буфере, pH 6.4); (1) – 50 мг/мл; (2) – 150 мг/мл; (4) – 200 мг/мл в 0.001 M фосфатном буфере, pH 7.3

Рис.4 Изменения радиусов кластеров R1 и R2 от концентрации белка m2: m2*- концентрация насыщения; 3V/Se- минимальный радиус устойчивого кластера, возникающего при m2 ( m2*ехр(-2(пSэNA/3RТ), 6V/Se - максимальный радиус устойчивого кластера R2 (или минимальный радиус устойчивого кластера R1 , возникающего в условиях насыщения раствора)

Рис.5. Три типа поведения линии границы устойчивости в координатах изменения химического потенциала воды (1 от концентрации белка m2 при разных концентрациях соли (в терминах активности ():

1. ( < 0 . Одна точка максимальной крутизны (В) и критическая точка (С). Одно метастабильное состояние A(D и квазиравновесие мономер-кластер.

2. ( > 0. Две точки максимальной крутизны (В) и (D) и критическая точка (С). Метастабильные состояния A(D и E(B свидетельствуют о динамической природе кластеров и непрерывном флуктуационном фазовом переходе.

3. ( = 2(2/(z2-(2). Тройная точка. Все фазы в равновесии.

F – граница твердой фазы

Рис.6. Теоретическая (1,2,3) и экспериментальная (4,5,6) зависимости растворимости лизоцима от концентрации NaCl при разных значениях рН (заряда белка z): (1) – рН 7 (z = 8); (2)- рН 5 (z = 10); (3)- рН 4 (z = 11); (4) – рН 4,3; (5) – рН 6,5; (6) – рН 8,4. Расчет теоретических кривых проведен при ( = 5. Экспериментальные данные из (Retailleau et.al., 1997);

(7) - экспериментальная и (8) - теоретическая зависимости начала высаливания лизоцима при рН 7. Параметры расчета: z = 8, ( изменяется от 6 до 7. Экспериментальные данные из (Dumetz et.al., 2008).

Рис.7. Связь критического состава X= (m2/m3)кр с эффективной температурой при вариациях концентрации соли. Кривая 1 соответствует низким концентрациям соли, ( < 0; кривая 2 для больших концентраций, ( > 0. Кривая 3 изменяется монотонно во всем диапазоне составов. При (m2/m3) > Q происходит температурная инверсия бинодали и двухфазная область возникает при повышении температуры.

Рис.8. Схематическое представление фазовой диаграммы системы вода-белок-соль в координатах температура- концентрация белка. Кривая 1 является линией растворимости белка; кривая 2 – граница твердой фазы; кривые 3 и 4 –бинодаль и спинодаль, соответственно, с ВКТР; 5 – бинодаль с НКТР. AB отражает равновесие кристалла с надосадочной жидкостью. S и m2* характеризует квазиравновесие разбавленной фазы и концентрированной фазы (высокосолевых кластеров), КТ –критическая точка. Стрелки- ее поведение при увеличении концентрации соли, Тт – температура тройной точки (все фазы в равновесии).

Рис.9 Зависимости экспериментального параметра d1/d, спектров ЭПР САЧ-СМ (77 К), от концентрации различных солей: (1) – CaCl2, концентрация белка 110 мг/мл, рН 6,4; (2) – NaCl, концентрация белка 40 мг/мл., рН 7,3; (3) – MgCl2, концентрация белка 90 мг/мл, рН 5,7; (4) - KSCN, концентрация белка 110 мг/мл, рН 6,4. Соединяющие линии проведены для удобства наблюдения.

Рис.10 Зависимость эффективных термодинамических функций состояния водно-белковой матрицы САЧ-СМ от концентрации солей: CaCl2 – (1,2,3), MgCl2 – (4,5) and NaCl- (6,7). (1) - (G; (2,4,6) - T(S; (3,5,7) - (H. Концентрация белка: с NaCl – 200 мг/мл (0.001 M фосфатный буфер, pH 7.3); с CaCl2 и MgCl2 (0.01 M ацетатный буфер, pH 6.4) - 110 мг/мл и 90 мг/мл, соответственно.

Приведено к 150С

Рис.11 Эффективные термодинамические функции состояния водно - белковой матрицы:

(3,6,9,12) – (G (точки) ; (1,5,8,11) – T(S (пунктир) ; (2,4,7,10) – (H (сплошные линии). Изменяется концентрация NaCl (m3) при концентрациях белка (m2) : (1,2,3) – 50 мг/мл; (4,5,6) – 100 мг/мл; (7,8,9) – 150 мг/мл; (10,11,12) – 200 мг/мл в 0.001 М фосфатном буфере, рН 7,3. Приведено к 15 0С.

Рис.12 Зависимости безразмерного параметра (G/(W, отражающего изменения свободной энергии Гиббса водно-белковой матрицы, от концентрации NaCl m3 при разных температурах: (1) –15 0С, (2) – 26 0С, (4) – 45 0С. 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,3. Концентрация САЧ-СМ 50 мг/мл .

Рис.13 Зависимости изменения микроскопического поверхностного натяжения ( в области локализации спиновой метки от отношения m2/m3. Вариации m2/m3 осуществляются за счет изменения концентрации белка при m3 = 0,15 M NaCl – (1); и соли m3, при m2 = 50 мг/мл - (2). Минимальное значение ( в присутствии гидратированных фуллеренов – (3).

Рис.15.Влияние фуллеренов (20 мкМ) на кинетические кривые восстановления парамагнетизма 5-Доксил-стеариновой кислоты в мембране теней эритроцитов– (1*,2*,3*) по сравнению с контролем (1,2,3). при разных концентрациях Fe+2 (M): 0,8 мM –(1); 0,4 мM – (2); 0,04 M – (3)

Рис.16 Влияние наноалмазов (ND) и наночастиц шунгитового углерода (ShC) на конформационную динамику, характеризуемую отношением W/S, белков актин-спектринового комплекса эритроцитов. (К) - контрольная суспензия мембран (теней) эритроцитов в 0,005 М фосфатном буфере, рН 8. (KD) и (NDD) – кривые “отжига” контрольной суспензии теней и теней в присутствии (ND), соответственно, при 600С. (KS) – контрольная суспензия теней в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4 + 0,15 М NaCl.

Рис.17 Зависимость параметра d1/d от концентрации NaCl (М) как ln(m3) при значении СВЧ мощности 12,6 мВт - (1) и 0,6 мВт – (2). Погрешность измерений входит в размер символа.


загрузка...