Эффекты кластеризации глобулярных белков в растворах (12.07.2010)

Автор: Рожков Сергей Павлович

Из условия (((1/(m2) = ( получаем уравнение линии, ограничивающей максимально стабильную твердую фазу F от других состояний раствора:

Уравнения (13)-(15) связывают критический состав системы (m2/m3)кр со специфическими характеристиками биополимера: (m2/m3)кр = f((, z, (). Все три линии сходятся в одной сверхкритической (тройной) точке с координатами (m2/m3) = 2/( при ( = 2(2/(z2-(2). В этой точке все фазы находятся в термодинамическом равновесии.

Экспериментальные фазовые диаграммы часто представляются в координатах изменения растворимости белка logS от концентрации соли (или ионной силы). Если logS представить в форме уравнения Дебая-Хюккеля, эквивалентному выражению в скобках в уравнении (12) (Бланделл, Джонсон 1979), тогда из уравнения (12) следует, что:

Уравнения (13) – (15), после их преобразования относительно параметра (, с помощью уравнения (16) приводятся к виду, соответственно:

+ const ; (17)

+ const; (18)

+ const , (19)

где уравнение (17) есть спинодаль, (18) – ноды бинодали, (19) – линия границы твердой фазы в координатах растворимости белка от концентрации соли.

Здесь наибольший интерес представляет уравнение (18), поскольку по смыслу рис.5 оно должно отражать существование двух фаз раствора с разными концентрациями белка, соответствующими длине ноды. Рассмотрим уравнение (18) вблизи критической точки. Так как m3 = m2(/n (уравнение 13), где n > 2 – положительные рациональные числа и 2(2 <z2, то уравнение (18), в пренебрежении малыми членами О(1/n2), будет иметь вид:

) + b, (20)

Здесь уравнение (18) трансформируется в уравнение Сеченова и характеризует линию “высаливания”, где 1/n играет роль безразмерной концентрации соли, а

- отрезок на оси ординат, полученный экстраполяцией прямолинейного участка на m3 = 0, или гипотетическая растворимость в отсутствии электролита. Ks определяет угол наклона экстраполяционной прямой в области “высаливания”:

. (22)

Этот коэффициент “высаливания” характеризует эффективность соли. Из уравнения (21) следует, что гипотетическая растворимость растет с ростом заряда белка и с числом адсорбированных ионов соли. Однако в области больших концентраций соли главным становится коэффициент высаливания и растворимость резко уменьшается с ростом (. Механизм этого явления раскрывается в теории предпочтительной гидратации белков в присутствии солей (Arakawa, Timasheff 1984).

В таком представлении в уравнении (20) величина S является концентрацией белка в разбавленной фазе, а m2 ( m2* - концентрацией белка в «фазе» кластера. Поэтому уравнение высаливания белка электролитом характеризует взаимосвязь между концентрациями белка в двух «фазах». Таким образом, зная заряд белка, число связанных анионов соли и ее концентрацию, а также концентрацию белка, при которой наступает высаливание, можно оценивать концентрацию белка в кластере. С другой стороны, если известна концентрация белка в разбавленной фазе и в кластере (иногда ее удается определить после центрифугирования раствора, в результате чего кластеры образуют макрофазу (Dumetz et.al., 2008 )), то можно оценивать число связанных с белком ионов.

Можно проверить адекватность уравнения (20) доступным экспериментальным данным для лизоцима. Чтобы установить соответствие безразмерного параметра 1/n и молярной концентрации соли NaCl (m3), которая обычно используется для высаливания и кристаллизации лизоцима, необходимо решить трансцендентное уравнение:

На рис.6 сопоставлены теоретически рассчитанные значения logS - 2ln(m2*) и экспериментальные значения logS при разных значениях рН (заряда белка z) и концентрациях NaCl. Растворимость лизоцима в работе (Retailleau et.al., 1997) определялась путем установления равновесия с кристаллом. Обычно с лизоцимом связано не менее 4-5 ионов Cl- и с ростом концентрации соли их адсорбция может возрастать. Из рис.6 видно, что тенденции в поведении теоретических и экспериментальных зависимостей качественно совпадают, но отличаются на величину ln(m2*)2, которая характеризует концентрацию белка в кластере. Расчетная концентрация оказывается несколько выше (около 700 мг/мл), чем реально наблюдаемая в кластере белка (около 500 мг/мл), получаемого в результате высаливания (Dumetz et.al., 2008 ).

На рис.6 также приведены данные по «растворимости» при концентрациях соли от 1 М NaCl и выше, полученные методом высаливания (Кривая 7). Концентрация белка, при которой в растворе появляется мутность, обусловленная возникновением кластеров, оказывается больше, чем в условиях равновесия (скачок на зависимостях в области 1М NaCl). Чтобы получить «скачок» на теоретических зависимостях, следует предположить, что часть ионов Cl- десорбируется при образовании кластеров.

Реальные значения ( можно получить из данных по изменению концентрации белка в кластерах или в геле лизоцима в зависимости от концентрации NaCl (Dumetz et.al., 2008 ). В этом случае расчет по прямому уравнению (18) показывает, что при 1 М NaCl с белком связано 4,5 иона Cl-, при 2 М NaCl – 6,5 иона Cl- и при 3 М NaCl - 6,9 иона Cl-, что согласуется с (Retailleau et.al., 1997). Таким образом можно определить число адсорбированных ионов электролита. При этом видна тенденция к насыщению в связывании анионов с ростом концентрации соли.

Температура является важнейшим фактором в механизме ФП и критической точки (КТ) можно достичь изменением температуры. Это предполагает существование взаимосвязи между температурой и критическим составом Х = (m2/m3)кт,. Параметр ? связан с температурой через константы d и Q уравнения Дебая-Хюккеля, где Q ~ С/((T)3/2. Здесь ? –диэлектрическая проницаемость, C - константа. Соотношение между Х = (m2/m3)кр и температурой можно получить, используя уравнение (13) и (14):

±1/( = (4-X2z2)/(2X2z2-4Xz2/( -8) (24)

±1/( = (X2z2-4X(+4)/(8X(-8) (25)

На рис.7 показана взаимосвязь критического параметра (m2/m3)cr и эффективной температуры: |1/(| ~ ((T)3/2. При заданной концентрации белка m2 кривые 1 и 2 на рис. 7 характеризуют температурное поведение критической точки при вариациях концентрации соли и соответствуют низким (( < 0) и высоким (( > 0) концентрациям соли, соответственно. Из рис.7 следует, что температура критической точки (и спинодали) возрастает с ростом концентрации соли при ( < 0, в то время как при ( > 0 температура критической точки уменьшается. Максимальной температуры спинодаль достигает при ( = 0 и составе: (m2/m3)кр = (1/()[1+(1+4(2/z2)0,5].

При условии ( > 0 поведение кривых 2 (для спинодали) и 3 (для нод бинодали) на рис.7 показывает, что с ростом m3 температура критической точки и температура нод понижается и достигает температуры минимальной (тройной точки), соответствующей значению |1/(| = N = (z2-(2)/ 2(2. Здесь состав системы удовлетворяет условию (m2/m3) = 2/(. При этой температуре и составе все фазы находятся в равновесии.

хкаЧаСЧСКхКСЧСКхКСЧСДСѕС·СЧ®§КСЧ®§КСЧС§СЧС§СК§СЧС§СЧС§СК§СЧС§СЧС§С

????????? или большие белка) температура фазового квазиравновесия расположена выше, чем критическая точка. Это система с нижней критической температурой растворения (НКТР). При составах m2/m3 слева от точки пересечения Q, но еще при ( < 0, температура фазового квазиравновесия ниже, чем у критической точки, т.е это система с ВКТР. Таким образом, есть основания предположить, что постепенное увеличение концентрации соли может приводить к постепенному переходу от системы с НКТР к системе с ВКТР и это может быть зарегистрировано экспериментально как фазовый переход.

Используя температурные зависимости критического состава на рис.7 и диаграмму рис 5, качественно можно представить фазовую диаграмму (ФД) растворимости системы в широко используемых координатах: температура – концентрация белка, где концентрация соли является варьируемым параметром (рис.8). Эта ФД аналогична общему (generic) типу диаграмм для глобулярных белков, (Muschol and Rozenberger, 1997). Повышение температуры критической точки (максимума спинодали) с увеличением концентрации соли при ( < 0 показано сплошной стрелкой, а при ( > 0 пунктирной стрелкой показано уменьшение температуры критической точки и стремление к тройной точке. «Низкосолевые» кластеры существуют на бинодали 5 на рис 8, а «высокосолевые» кластеры существуют на бинодали S - m2* на рис 8.

На рис.8 для системы с ВКТР верхняя точка спинодали и бинодали является критической. При изменении температуры или состава системы вода-белок-соль здесь имеет место критический ФП флуктуационного типа, когда обе фазы, сосуществующие при более низких температурах, становятся тождественными при ее повышении. При этом, в соответствии с теорией непрерывных фазовых переходов (Базаров,1983), у системы сначала появляются свойства однородной системы, а потом, будучи в целом однородной, у нее пропадают свойства двухфазной системы. Этот переход может занимать значительный участок фазовой диаграммы и представлять собой область закритических ФП (область между бинодалью и кривой растворимости).Здесь могут существовать динамические кластеры белка с ограниченным временем жизни, метастабильные по отношению к обеим граничным фазам белка. Аналогичные процессы и динамические кластеры могут существовать и в системе с НКТР. Поскольку механизмы образования систем с НКТР и ВКТР различны, различны должны быть и динамические кластеры. Согласно существующим данным, в растворах лизоцима обнаруживаются два типа динамических кластеров размерами ~ 10 нм и 100 нм. Первые из них характерны для низкосолевых растворов и являются динамическими компактными олигомерами белка (Stradner et.al. 2006).

активности имеет место при 0,3 – 0,5 М, то для NaCl пологий минимум существует около 1,5 М концентрации.

Регистрировали индуцированные солями изменения в спектрах ЭПР модифицированных белков и сравнивали со спектрами белков в буферных растворах без соли. При этом анализировались параметры спектров (ширина линий, расстояния между экстремумами линий и соотношение амплитуд) в диапазоне температур от 77К до 318 К, позволяющие получить информацию о диполь-дипольных взаимодействиях спин-меток и средних расстояниях между молекулами белка (рис.9), их диффузионных характеристиках (рис.1) и термодинамических функциях состояния водно-белковой матрицы (рис 10,11).

На бинодали фазовой диаграммы, при температурах ниже критической, для многих белковых систем имеет место фазовый переход типа жидкость-жидкость, приводящий к фазовому разделению и образованию метастабильных концентрированных кластеров белка. Макроскопическое проявление этого явления в солевых растворах сопряжено с высаливанием. Для многих белков эффект наблюдается в области субнулевых температур. Согласно выводов Главы 4, увеличение концентрации соли будет приводить к смещению бинодали из области низких в область комнатных (физиологических) температур. При этом в эксперименте при комнатной температуре, согласно выводов Главы 4, может наблюдаться фазовый переход, связанный с «плавлением» низкосолевых динамических кластеров -олигомеров и появлением высокосолевых динамических кластеров и даже концентрированных микрофаз белка при высаливающих концентрациях солей.

По данным литературы (Zhang et.al, 2007) в водно-солевых растворах сывороточного альбумина быка при комнатных температурах не было обнаружено явных признаков ФП типа L-L. Наши же результаты свидетельствуют о наличии фазовых переходов типа «плавления» в растворах САЧ при более низких температурах (рис.10 и рис.11). Возможно, это обусловлено большей склонностью САЧ к взаимодействию и агрегации, чем САБ и более низким диапазоном температур исследования. Повышенные значения параметра d1/d в диапазоне низких концентраций соли наиболее вероятно указывают на наличие компактных кластеров-олигомеров. При умеренном повышении концентрации соли эти кластеры «плавятся» и исчезают, о чем говорит уменьшение d1/d и скачок термодинамических функций состояния .

В диапазоне больших концентраций солей (близких к высаливающим) появляются динамические «высокосолевые» кластеры и новые концентрированные фазы белка субмикронных размеров с несколько большим расстоянием между молекулами белка, чем в «низкосолевых» олигомерах (рис.9). В растворах САЧ с CaCl2 и MgCl2 они становятся визуально заметны по увеличению мутности. Однако при дальнейшем увеличении концентрации соли раствор становится вновь прозрачным. Вероятно, здесь имеет место критический фазовый переход. Для этих солей на рис.10 изотерма Т(S в верхней точке сливается с изотермой (G, т.е. (G ( Т(S. Таким образом, энтропия начинает управлять поведением системы, что характерно для критического фазового перехода (Юркин, 1991). Кроме того, зависимость параметра ((2Tr в области плато (рис.3) соответствует нулевым значениям высших производных удельной свободной энергии вплоть до четвертой, что также является термодинамическим признаком критического ФП (Моравец, 1967). Вероятно, возможность наблюдать критический переход обусловлена снижением температуры критической точки в условиях высоких концентраций двухвалентных солей, т.е. при условии ( ( 0 и попаданием ее в область температур эксперимента. В этом случае раствор белка представляет собой смесь флуктуационных зародышей обеих граничных фаз при сохранении макроскопической прозрачности (рис.5, кривая 2).

В растворах САЧ с NaCl критического фазового перехода визуально наблюдать не удается, как и кластеров новой фазы, но по мере уменьшения концентрации белка и соли амплитуда скачка (при постоянном значении m2/m3, что согласуется с уравнением (13)) убывает (см. рис.11). Это может свидетельствовать о приближении к критическому фазовому переходу, причем со стороны высоких концентраций белка (рис.8).

Солью индуцируемый структурный фазовый переход (ФП) можно интерпретировать как фазовый переход воды, участвующей в гидратации низкосолевых и и высокосолевых динамических кластеров белка. В таком представлении спиновая метка является индикатором термодинамических изменений гидратации в процессе ФП. Отрицательные значения термодинамических функций (H, Т(S, (G свидетельствуют, что закрытое (А) – состояние полости в структуре белка, где локализована спин-метка, термодинамически более стабильно, чем открытое для растворителя В- состояние. В «низкосолевой» зоне эта стабилизация сильнее.

Поскольку фазовый переход на рис.10 и рис.11 сопровождается увеличением среднего расстояния взаимодействия между молекулами белка (рис.9), есть основания считать, что под действием соли плотные динамические кластеры белка – олигомеры разрушаются и образуются более «рыхлые», но большего размера динамические кластеры второго типа, постепенно формируя метастабильные микрофазы, обогащенные белком.

При относительно плавном поведении (G(m3). на рис.10 и рис.11, следует отметить существование пологого экстремума при определенной концентрации соли. С ростом концентрации белка экстремум сдвигается в область больших концентраций соли (Рожков, Борисова 1993). Для более точного анализа (G(m3). использован подход с влиянием вязкости раствора на соотношение амплитуд спектра ЭПР САЧ-СМ (Глава 3). Рассчитанные таким образом данные представлены на рис.12. В таком виде они представляют собой зависимость безразмерной энергии Гиббса А-состояния водно-белковой матрицы от состава. По краям солевого интервала структура белка более жесткая (стабилизация А-состояния полости), чем в середине, где происходит перестройка структуры раствора из «низкосолевой» (кластеры первого типа) в «высокосолевую» (кластеры второго типа). При температуре 45 0С фазовый переход не регистрируется.

Фазовый переход в середине солевого интервала сопряжен с ростом частоты вращения метки (рис.1), с ростом растворимости белка (рис.3), и с ростом расклинивающего давления воды в ВБМ, характеризующего увеличение гибкости белка.

На рис.13 показано поведение удельной поверхностной энергии в области локализации спиновой метки на поверхности белка в зависимости от состава раствора. Увеличение концентрации белка ведет к росту энергии, однако с появлением кластеров рост ( компенсируется. Плавление белковых кластеров 1 типа и их превращения во 2 тип с ростом концентрации соли существенным образом в значениях ( не проявляется.

Несмотря на то, что представленные здесь данные характеризуют взаимодействие белок- растворитель, качественное объяснение результатов можно провести на основе взаимодействия белков. В этой главе на основе коллоидного подхода (теория ДЛФО) обсуждается возможная структурно-динамическая модель раствора белка. Она оперирует белковыми кластерами-олигомерами, располагающимися на расстоянии второго энергетического минимума потенциальной энергии взаимодействия. При этом мономеры белка окружают кластеры на расстоянии первичного энергетического минимума и обеспечивают стабилизацию как коллоидного состояния раствора, так и стабилизацию структуры белка (закрытое А-состояние полости белка, где локализована спин-метка). На основании этой модели удается качественно объяснить «плавление» кластеров-олигомеров действием электролита на величину и положение потенциальных барьеров энергии взаимодействия кластеров и молекул белка.


загрузка...