Рациональная антимикробная фармакотерапия современных внутрибольничных инфекций (12.07.2010)

Автор: Иванов Дмитрий Валерьевич

1.2. Экспериментальные исследования

Экспериментальные исследования выполнялись на крысах породы SD. Использовали механическую модель создания инфаркта миокарда. Культуру клеток, меченная флуоресцентной меткой, вводилась интрамиокардиально с помощью катетера через 30 суток после моделирования инфаркта миокарда. У животных регистрировались изменения в ЭКГ, системном и левожелудочковом давлении, толерантность к физическим нагрузкам.

2. Методы исследования

2.1. Общеклинические методы

Общеклинические исследования включали: сбор анамнеза, результаты объективного обследования, применение лабораторных, инструментальных и функциональных методов диагностики.

2.2. Биохимические методы

); лейкоцитарная формула (дифференцированный подсчет лейкоцитов); СОЭ, АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время); протромбин, МНО (INR); альбумин; общий белок; белковые фракции; креатинин; мочевина; мочевая кислота; глюкоза; холестерол общий (холестерин); холестерол-ЛПВП (холестерин липопротеинов высокой плотности); холестерол-ЛПНП (холестерин липопротеинов низкой плотности); билирубин общий; билирубин прямой; АлАТ (аланинаминотрансфераза); АсАТ (аспартатаминотрансфераза); гаммаглутамилтранспептидаза; холинэстераза; вирус гепатита В, определение ДНК (качественное) (HBV–DNA); вирус гепатита С, определение РНК (качественное) (HCV–RNA); вирус гепатита D, определение РНК (HDV–RNA); С-пептид; альфа-фетопротеин; раково-эмбриональный антиген; ПСА общий (простатический специфический антиген общий); ПСА свободный (простатический специфический антиген свободный); Са 15–3 (углеводный антиген 15–3); Са–125 (углеводный антиген 125); Са 19–9 (углеводный антиген 19–9); антитела к инсулину; антитела к бета-клеткам поджелудочной железы.

2.3. Оценка клеточного материала

2.3.1. Биобезопасность

Весь клеточный материал проверялся с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) на отсутствие следующих бактерий и вирусов: вирус герпеса 1 и 2 типа, цитомегаловирус, вирус Эпштейн–Барр, вирусы гепатита В, С, Д, хламидии, уреаплазма, микоплазма, токсоплазма, бледная трепонема.

2.3.2. Оценка жизнеспособности и количества клеток

Производилась с помощью трипанового синего. В дальнейшем в микроскопе происходит подсчет клеток и определение жизнеспособности в камере Горяева.

На автоматическом счетчике клеток «Countessтм» фирмы Invitrogen (США) результаты получаются в виде визуальных и графических рисунков (рис. 1).

Рис. 1. Результат тестирования клеток: 1 – живые клетки, 2 – нежизнеспособные. По вертикали количество, по горизонтали размер

2.3.3.Иммунофенотипирование

Проводилась на проточном цитометре FACScan (Becton Dickinson, США) и результаты получались в виде графических данных (рис. 2).

Рис. 2. Графические данные иммунофенотипирования:

1 – клетки с фенотипом CD45+; 2 – клетки с фенотипом CD14+

2.4. Специальные методы исследования

2.4.1. Инструменты оценки качества жизни

Дизайн исследования был разработан с помощью сотрудников Научно-методического центра мониторинга качества жизни Минздрава России. Качество жизни больных исследовалось с помощью русскоязычных версий опросников: общий опросник оценки качества жизни – MOS SF–36 и общий опросник оценки качества жизни – EuroQol – EQ-5D.

2.4.2. Спортивный комплекс упражнений

Комплекс упражнений был разработан совместно с сотрудниками кафедры биохимии Российского Государственного Университета Физической Культуры, Спорта и Туризма и представлял собой специальный тест. Тест включал три упражнения (разгибание ног сидя для мужчин с постоянным весом для всех, сгибание ног лежа для женщин с постоянным весом для всех; подтягивание на перекладине с собственным весом, отжимание на брусьях без отягощений).

2.4.3. Исследования экспериментальных животных

Наблюдения и измерения в ходе исследования. Внешний вид, смертность. Наблюдение за животными для выявления отклонений в состоянии здоровья и смертности проводили ежедневно в первой половине дня.

Клинический осмотр каждого животного проводили еженедельно.

Масса тела. Животных взвешивали перед операцией моделирования инфаркта миокарда, перед трансплантацией клеток и перед эвтаназией. Масса тела, определенная после ночи голодания перед некропсией, использовалась для подсчета относительной массы органов.

Толерантность к физическим нагрузкам. Толерантность животных к физическим нагрузкам была изучена в тесте плавания перед трансплантацией клеток и перед выведением животных из эксперимента.

ЭКГ регистрировали с помощью системы мониторирования «HemoDynamics» v. 1.1. (ИБК РАН, Россия) при наложении электродов на правую переднюю лапу, на грудь и на правую заднюю лапу.

При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренних поверхностей и проходов. При проведении некропсии фиксировали органы печень, сердце, легкие, селезенку.

2.5. Статистическая обработка

Обработка результатов проведенных исследований проведена с оценкой различий по методу Стьюдента (Excel 7.0), Статистический анализ проводился программой Statistica 6.0. Различия определяли при P<0.05%. При расчетах использовали программу Biostat for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Предпосылки клинического применения клеточных технологий

Стволовые клетки (СК), полученные из костного мозга пациента, клинически используются в лечении гематологических заболеваний более 40 лет. В последние годы стали получать СК из крови пуповинного канатика.

СК обладают отличительными от других клеток свойствами – они недифференцированные, незрелые, способны к пролиферации, самообновлению, превращению в дифференцированные клетки и регенерирующие ткани, при делении – всегда дают себеподобную клетку. Имеются два основных вида клеток: эмбриональные и неэмбриональные, к которым относятся, например фетальные клетки. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) являются плюрипотентными, потому что они могут дифференцироваться во все типы клеток. В отличие от ЭСК неэмбриональные СК являются мультипотентными, так как их потенциал дифференцироваться в различные типы клеток ограничен. Различие между ЭСК и неэмбриональными клетками – также в превалировании и большем потенциале к спонтанной дифференцировке у ЭСК, чем у неэмбриональных клеток.

ЭСК получают из внутренней клеточной массы бластоцисты, которая формируется на седьмой день после фертилизации. Если на данной стадии бластоциста имплантируется в ткани матки, то внутренняя клеточная масса развивается в фетус с окружающим трофобластом, который превращается в плаценту. Первые линии человеческих ЭСК были получены из внутренней клеточной массы эмбриона в 1998 году (Thomson J.A. et al., 1998). С того времени было получено, как минимум 225 линий человеческих ЭСК. Линии ЭСК создаются с помощью размещения клеток на фидерных слоях из фибробластов. Фидерные слои помогают поддерживать ЭСК в недифференцированном состоянии. Теоретически линии человеческих ЭСК могут быть получены нефизиологическим способом, известным как терапевтическое клонирование, когда происходит перенос ядра из одной клетки в другую. Например, ядро донорской соматической клетки (клетки кожи) переносится в цитоплазму яйцеклетки без ядра. В дальнейшем, благодаря находящимся в данной гибридной яйцеклетки факторам, она дифференцируется в бластоцисту. Линии ЭСК, которые получают из внутренней клеточной массы данной бластоцисты, имеют такую же ядерную ДНК, как и донор. Зрелые клетки, полученные из этой линии, не должны отторгаться, если вводятся донору.

Неэмбриональные СК известны также как взрослые СК, потому что получают их из развитого организма, обычно костного мозга. Этот источник имеет два типа СК: гемопоэтические, которые дифференцируются в клетки крови и являются CD34+ (положительны) и мезенхимальные (стромальные) клетки, которые дифференцируются в клетки костной, хрящевой ткани и являются CD34– (отрицательные). Другие источники получения неэмбриональных СК являются носовая полость, мышцы, печень, кожа, головной мозг, сетчатка и лимбус глаза, жировая ткань. Начались разработки получения эндометриальных СК. К неэмбриональным СК также можно отнести клетки из менее зрелых источников, включая кровь пуповинного канатика при рождении, плаценту и фетальные соматические ткани, такие как печень и поджелудочная железа.

В связи с увеличивающимся интересом к клиническому применению СК, практикующим врачам необходимо знать при каких заболеваниях эти клетки применяются. Поэтому для целей клинической практики нами была разработана собственная классификация различных видов клеток, обусловленная возможностью их практического применения в клинике.

Вид клеток


загрузка...