Аналитические подходы к лабораторной диагностике социально значимых вирусных заболеваний (11.10.2010)

Автор: Сидорова Ирина Флуровна

Среди обследованных доноров дважды серопозитивных по вирусу иммунодефицита человека в иммуноферментном анализе выявлено 160 лиц, что составляет 0,16 % от общего числа донаций. Серонегативных по данной инфекции оказалось 100 733 (99,8%) человека (табл. 2).

Таким образом, от 0,2 до 1,5 % потенциально опасной донорской крови удается выбраковывать по показателю инфицированности возбудителями социально значимых вирусных инфекций методом ИФА.

Однако отрицательный результат выявления серологических маркеров инфекции в иммуноферментном анализе даже при проведении подтверждающего теста не означает полной инфекционной безопасности крови и ее компонентов. Для гемоконтактных заболеваний существует период серонегативного «окна» – промежуток времени от момента инфицирования до появления серологических маркеров заболеваний, который может составлять несколько недель. Применение метода полимеразной цепной реакции, основанного на выявлении нуклеиновых кислот вирусов, может существенно сократить этот период (Бацких С.Н. с соавт., 2007, Brojer E. et al., 2006, Liu C.J. et al., 2006). В то же время, в некоторых случаях в период латентной стадии заболевания или при хроническом процессе сыворотка пациента содержит крайне низкий уровeнь РНК вируса гепатита С.

Некоторые исследователи считают, что ПЦР не может использоваться в качестве единственного метода в массовых скрининговых исследованиях (Allain J.P., 2004, Dhatti F.A. et al., 2007). Несмотря на более чем пятилетнюю практику внедрения ПЦР в качестве обязательного метода в службу крови некоторых стран, вопрос о целесообразности использования этого дорогостоящего метода в скрининге доноров остается открытым (Арсенин С.Л., 2001; Пак С.Г., Малов В.А., 2002; Legler T.G., 2000; Loubiere S., 2001; Bush M.P., 2003; Jackson M.P. et al., 2003; Pillonel J., 2005;).

В настоящее время тестирование донорской крови методом полимеразной цепной реакции на наличие вирусных нуклеиновых кислот в Российской Федерации не является обязательным. По Приказу Минздравсоцразвития РФ от 16.04.2008 N 175н только плазму, предназначенную для фракционирования, с отрицательными результатами серологических ИФА-тестов объединяют в минипулы и подвергают исследованию на наличие нуклеиновых кислот ВИЧ, вирусов гепатитов В, C.

С целью улучшения выявления гемотрансмиссивных вирусных заболеваний, в частности ВИЧ-инфекции, все отрицательные в ИФА образцы донорской крови были исследованы нами методом ПЦР.

Из 38 239 серонегативных донаций, исследованных методом полимеразной цепной реакции, РНК вируса гепатита С была обнаружена в 34 (0,09 %) пробах, не содержали РНК НСV - 38 205 (99, 91%) образцов крови.

Из 100 серопозитивных образцов вирусная РНК была обнаружена в 64 случаях (рис.4).

Рис.4. Результаты тестирования методом ПЦР доноров серопозитивных в ИФА по антителам к вирусу гепатита С

Из 30 691 донации, серонегативной в иммуноферментном анализе, удалось выявить 1 (0,003%) образец, который содержит РНК ВИЧ, что, свидетельствует о присутствии в данной пробе вируса иммунодефицита человека. Донор при сдаче крови находился в стадии «серонегативного окна», его длительность в среднем 1-3 недели. Большая часть донаций, а именно 30 690 (99,997%) проб не содержала РНК ВИЧ (табл. 3).

Таблица 3

Результаты выявления РНК ВИЧ в серонегативных образцах

донорской крови

Маркер вируса

иммунодефицита человека Обследовано

доноров Результаты полимеразной

цепной реакции

РНК ВИЧ

определена,

% РНК ВИЧ

не определена,

РНК ВИЧ 30 691 1 (0,003) 30 690 (99,997)

Небольшое количество выявленных положительных проб свидетельствует о высокой диагностической эффективности использованных в исследовании широко распространенных иммуноферментных тест-систем, в то же время благодаря генамплификационному методу выявляются доноры, находящие в стадии серонегативного «окна» или имеющие низкие концентрации серологических маркеров, кровь которых потенциально может быть перелита реципиентам. Проведенные исследования доказывают целесообразность тестирования на выявление нуклеиновых кислот ВИЧ и вирусных гепатитов в службе крови.

Эффективность лабораторной диагностики гепатита В ограничивает отсутствие в Российской Федерации нормативной базы по контролю качества неколичественных методов исследования. Обязательный контроль аналитической чувствительности в отечественной лабораторной практике проводится только с помощью Отраслевого стандартного образца, утвержденного ГИСК им. Тарасевича ОСО-HBsAg с концентрацией 20 МЕ/мл и не имеющего статуса Национального стандарта.

Одним из путей повышения эффективности лабораторной диагностики является улучшение аналитических характеристик применяемых в лабораторной практике диагностических тестов.

В 2007 году в Российской Федерации были зарегистрированных и разрешены к применению не имеющие зарубежных аналогов иммуноферментные тест-системы нового поколения для выявления и подтверждения HBsAg с чувствительностью 0,01 МЕ/мл, в 10 раз превышающей требуемую согласно Приказа МЗ РФ №322 от 21.10.02 г. - "ИФА-Бест- HBsAg" производства ЗАО "Вектор-Бест" и "ДС-ИФА- HBsAg-0,01" производства ООО "НПО "Диагностические системы". Для оценки их диагностической эффективности 534 образца сыворотки крови практически здоровых лиц были нами проанализированы одновременно в двух ИФА системах –"ИФА - Бест - HBsAg" и тест-системе "ДС – ИФА - HBsAg" с разрешенной в настоящее время чувствительностью выявления HBsAg 0,1 МЕ/мл (табл. 4).

Таблица 4

Результаты выявления HBsAg в тестах с разной чувствительностью

Кол-во Тест с чувствительностью

0,01 МЕ/мл Тест с чувствительностью

0,1 МЕ/мл

Отриц. в скрининге Первично полож. Положит.

в подтв. тесте Отриц. в скри-нинге Первично положит. Положит. в подтв. тесте

Абс. % от общего

Абс. % от общего кол-ва

534 527 7 6 1,31 527 7 5 0,94

При первичном скрининге обе тест-системы выявили по 7 положительных образцов, 5 из которых совпали. После проведения подтверждающего исследования в более чувствительной системе подтвердились 6, а в менее чувствительной - 5 образцов, содержащих HBsAg - один положительный образец не был выявлен тест-системой с меньшей чувствительностью.

Меньшее количество неподтвержденных ложноположительных при первичном исследовании результатов в тест-системе нового поколения свидетельствует о более высокой специфичности наряду с более высокой чувствительностью.

Таким образом, тест-системы с повышенной чувствительностью выявления HBsAg позволяют выявлять образцы с низким его содержанием - на уровне одной инфицирующей дозы вируса гепатита В. Нам представляется целесообразным применение тестов с чувствительностью не менее 0,01 МЕ/мл при скрининге донорской крови. Экономические затраты на их внедрение существенно ниже, чем при организации массового скрининга доноров методом ПЦР, поскольку не требуется дополнительного оснащения лаборатории, дешевле тест-системы. Стоимость реагентов на одно определение составляет в среднем 12-15 рублей, что 1,8-2 раза больше, чем при использовании тестов с низкой чувствительностью, но в 3-4 раза меньше, чем стоимость одного определения методом ПЦР с использованием отечественных реагентов.

Одной из общих проблем лабораторной диагностики вирусных инфекций является высокая гетерогенность и изменчивость вирусов, появление трудно диагностируемых геномных мутаций. В настоящее время изучение мутантных форм HBsAg перешло из области академического интереса в практику, поскольку эти мутации могут обусловить ложнонегативный результат при первичном обследовании пациента, что особенно важно в службе крови, где выявление инфицированности вирусом гепатита В у доноров проводится только по одному тесту на обнаружение HBsAg (Levicnik-Stezinar S., 2004, Roque-Afonso A.M. et all., 2005, Tabor E., 2006). Согласно последним исследованиям, наиболее часто встречающимися «ускользающими» мутациями являются замены в 145 и 143 аминокислотных положениях ?-детерминанты HBsAg (Уланова Т.И. с соавт., 2007, Bartholomeusz A., 2006).


загрузка...