Механизмы регуляции апоптоза в нейроэндокринной системе гипоталамуса в позднем онтогенезе (11.10.2010)

Автор: Бажанова Елена Давыдовна

Рис. 15. 15А Содержание р53 мРНК в НСК СОЯ и ПВЯ. 15В Содержание WRN мРНК в НСК СОЯ и ПВЯ, по оси У: проценты. 15С,D Микрофотография ПВЯ старых мышей SHR (C), HER2/neu (D), увел. х400. ИГХ реакция с антителами к р53.

Рис. 16. Содержание Bcl-2-ИР (16А), Mcl-1-ИР (16В), Вах-ИР (16С), caspase-8-ИР (16D) материала в НСК СОЯ и ПВЯ, по оси У: оптическая плотность.

Одной из причин повышения уровня апоптоза в ПВЯ старых SHR мышей может быть снижение экспрессии Mcl-1 и Bcl-2 (Рис. 16А, В). С другой стороны, аналогичное снижение уровня Mcl-1 в СОЯ и ПВЯ старых мышей HER2/neu не влияет на устойчивость к апоптозу (Рис. 16В). Очевидно, причиной этого является супрессия основных апоптотических путей в клетках трансгенных мышей.

et al., 2004). Наше исследование показало, что повышенная экспрессия Bax в СОЯ старых мышей SHR является, возможно, одним из факторов, опосредующих высокий уровень клеточной смерти. Кроме того, мы обнаружили значительное снижение уровня Вах в НСК трансгенных мышей только в ПВЯ. Можно заключить, что это подавление синтеза Вах связано с показанной нами HER2/neu-зависимой супрессией р53 и, далее, caspase-8 (Рис. 16С,D).

Анализ интенсивности экспрессии ВП (ВП мРНК) и количества ВП-ИР вещества в НСК как показателя функциональной активности СОЯ и ПВЯ выявил, что активность этих ядер зависит от генетической линии мышей (Рис. 17, 18). Мы выявили, что сверхэкспрессия HER2 вызывает увеличение синтеза ВП в НСЦ, независимо от возраста животного. Кроме того, мы показали, что гипоталамические центры поддерживают постоянный уровень активности при старении у мышей дикого типа, однако эти ядра в состоянии значительно увеличивать секрецию ВП у трансгенных мышей, т.е. дополнительная активность гена HER2/neu у трансгенных животных влияет на основную функцию НСК.

Таким образом, выявлен сигнальный каскад супрессии апоптоза при HER2/neu сверхэкспрессии (см. предложенную нами сх. - Рис. 19). Основным механизмом подавления апоптоза у трансгенных мышей является блокирование р53-зависимого каскада, что приводит к снижению синтеза caspase-8 и Вах, дисрегуляции синтеза антиапоптотических белков Bcl-2 и Mcl-1. Обнаружена

Рис. 17. Уровень синтеза ВП в НСК гипоталамуса. 17а – количество мРНК ВП в СОЯ и ПВЯ. 17б – Количество ВП-ИР материала в СОЯ и ПВЯ.

Рис. 18. In situ гибридизация для выявления мРНК ВП с использованием меченых дигоксигенином рибопроб в гипоталамусе HER2/neu мышей и мышей дикого типа (SHR). OC – оптическая хиазма (optic chiasma), IIIv – третий желудочек (III ventriculum). увел. х400. a – количество ВП мРНК в СОЯ молодых мышей SHR; b - количество ВП мРНК в СОЯ молодых мышей HER2; c - количество ВП мРНК в ПВЯ молодых HER2 мышей; d - количество ВП мРНК в ПВЯ старых HER2 мышей.

В Рис. 19. А Сигнальный каскад апоптоза при физиологическом старении,

В Сигнальный каскад апоптоза при старении НСК трансгенных мышей HER2/neu.

возможная причина подавления р53-опосредуемого апоптоза у HER2-трансгенных мышей – низкая экспрессия гена WRN, регулирующего синтез р53. Важным фактором, принимающим участие в повышении выживания клеток гипоталамуса трансгенных животных, является 17?-эстрадиол, уровень которого в плазме крови не снижается при старении. Результатом всего этого является повышенное выживание НСК старых трансгенных мышей HER2/neu.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Cтарение является сложным многофакторным процессом, ассоциированным с широко распространенными изменениями в экспрессии генов во многих тканях млекопитающих. Среди множества причин старения чаще всего называют свободнорадикальное окисление (Gupte et al., 2010), повреждение ДНК вследствие оксидативного стресса или других причин, укорочение теломер (Olovnikov, 1996; Eller et al., 2006; Ding and Shen, 2008). Все это может активировать р53 в стареющих клетках, что было изучено на тканях, клетки которых способны к размножению в течение жизни особи (Edwards et al., 2007). Однако молекулярные механизмы старения постмитотических нейронов в условиях in vivo оставались до сих не изученными. Каждый этап онтогенеза требует своих «триггеров» и имеет свои «точки начала». Механизмы инициации инволюционных изменений до сих пор являются предметом дискуссии.

Результаты наших исследований пептидергической и катехоламинергической систем гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы показывают, что старческие изменения начинаются в первую очередь в центральных регуляторных органах (нейросекреторные центры гипоталамуса), и далее уже распространяются на периферическое звено, что обуславливает нарушения стрессорного ответа и адаптации у животных на поздних этапах онтогенеза.

Вазопрессин, один из основных нейрогормонов, играет важную роль во многих реакциях организма. Мы показали, что старые животные в состоянии поддерживать уровень синтеза вазопрессина, сравнимый с таковым у молодых, но это является результатом морфофункционального напряжения стареющих нейросекреторных клеток. Более того, синтез вазопрессина зависит от генотипа животного, так, он значительно повышен у старых HER2/neu трансгенных и TNF-нокаутных мышей.

Нами был подробно изучен механизм реализации старческих изменений в нейросекреторных клетках гипоталамуса. Мы выявили, что при физиологическом старении у мышей происходит значительная потеря нейронов крупноклеточных нейросекреторных центров (супраоптическое и паравентрикулярное ядра), и эти нейроны гибнут путем апоптоза. Ранее подобные данные были получены различными авторами при изучении патологического старения. Так, показано повышение апоптоза нейронов фронтальной коры и гиппокампа у больных болезнью Альцгеймера и допамин-продуцирующих нейронов в стриатуме и substantia nigra при болезни Паркинсона (Mattson et al., 1999, 2001), мотонейронов спинного мозга у больных боковым амиотрофическим склерозом (Kim et al., 2001) и т.д. Выявленные нами сигнальные пути апоптоза нейронов мозга при старении отличаются от таковых у молодых животных (см. предлагаемую нами схему - Рис. 20). Также показана тесная связь сигнального каскада апоптоза с генотипом животного.

Рис. 20. Сигнальные пути апоптоза в различных НСЦ при старении.

Таким образом, рассмотрены возможные пути реализации апоптоза нейронов гипоталамуса на поздних этапах онтогенеза и выявлены основные закономерности клеточной гибели у животных при различных воздействиях и использовании иммуномодуляторов. У старых животных в реализации апоптоза участвуют внешний путь активации (через caspase-8), митохондриальный путь (изменения экспрессии белков семейства Bcl-2) и р53-зависимый путь, связанный с повреждением ДНК. На основании полученных данных можно заключить, что наиболее важное значение на поздних этапах онтогенеза приобретает р53-зависимый путь, и блокада этого каскада приводит к нарушению возраст-зависимой активации апоптоза и снижению продолжительности жизни.

1. В нейроэндокринной системе при старении происходит массовая элиминация клеток путем апоптоза. В первую очередь изменяется функция центрального звена эндокринной системы, что является одной из причин возрастных изменений периферических эндокринных органов. Сохранившиеся нейроны супраоптического и паравентрикулярного ядер вынуждены поддерживать синтез нонапептидов на уровне физиологических потребностей, и в связи с этим находятся в состоянии функционального напряжения. Экспрессия нейромодуляторных пептидов, таких как нейропептид Y и инсулин/инсулиноподобные пептиды, в нонапептидергических нейронах гипоталамуса при старении снижается.

2. Экспрессия про- и антиапоптотических белков в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах молодых мышей одинакова, несмотря на то, что эти центры играют разную роль в регуляции функций организма. У старых мышей в изучаемых нейросекреторных центрах усиливается экспрессия проапоптотических белков р53 и caspase-8, снижается содержание инсулина/ инсулиноподобных пептидов (фактора выживания клеток). Однако в паравентрикулярном ядре, кроме того, уменьшается экспрессия Mcl-1 и Bcl-2, а в супраоптическом – усиливается экспрессия проапоптотического белка Вах, т.е. при старении сигнальные каскады и уровень апоптоза в супраоптическом и паравентрикулярном ядрах различаются.

3. Инактивация гена TNF in vivo (TNF-нокаутные мыши) не влияет на синтез сигнальных белков апоптоза в нейросекреторных клетках. При старении наблюдается активация апоптоза нейросекреторных клеток TNF-нокаутных мышей по caspase-8-зависимому пути, и отсутствие гена TNF не влияет на активность данного процесса.

4. Повышенная экспрессия онкопротеина HER2/neu вызывает усиление синтеза вазопрессина в нейросекреторных центрах трансгенных мышей. При старении у трансгенных мышей синтез вазопрессина увеличивается не только по отношению к мышам дикого типа, но и по сравнению с молодыми трансгенными мышами.

5. Экспрессия гена синдрома Вернера WRN, регулирующего синтез и функциональную активность онкосупрессора р53, в нейросекреторных клетках при физиологическом старении увеличивается, что приводит к интенсификации синтеза р53 и, как следствие, высокому уровню апоптоза.

6. Сверхэкспрессия HER2 у трансгенных мышей блокирует экспрессию WRN при старении, выраженную у старых мышей дикого типа. Низкий уровень WRN не приводит к активации р53 и таким образом подавляет последующий каскад апоптоза: показана супрессия синтеза проапоптотических белков Вах и caspase-8. Как следствие, у трансгенных мышей при старении не происходит активации апоптоза нонапептидергических нейронов гипоталамуса. Сверхэкспрессия тирозинкиназного рецептора HER2 блокирует сигнальный путь р53, влияя как на белки, регулирующие р53, так и на р53-зависимые белки.

7. Иммуномодуляторы (интерферон-альфа и индуктор эндогенного интерферона - циклоферон) снижают активность вазопрессинергических нейронов. Так, интерферон-альфа оказывает супрессорный эффект на синтез вазопрессина, инсулина/ инсулиноподобных пептидов и Bcl-2, циклоферон снижает экспрессию Вах и Bcl-2 у молодых и старых мышей. Экзогенный интерферон-альфа не является протектором апоптоза нейронов гипоталамуса при старении, напротив, индукция эндогенного интерферона введением циклоферона снижает апоптоз во всех изученных группах. Введение интерферона-альфа и циклоферона перед стрессом снижает уровень апоптоза в ядрах гипоталамуса только у старых животных, т.е. участие иммуномодуляторов в регуляции гибели нейронов гипоталамуса зависит от стадии онтогенеза и от вида иммуномодулятора.

8. При старении в активации апоптоза участвуют внешнерецепторный путь (через caspase-8), митохондриальный (изменения экспрессии белков семейства Bcl-2) и р53-зависимый путь, связанный с повреждением ДНК. В тканях, где экспрессия р53 конституитивно снижена (трансгенные мыши со сверхэкспрессией онкогена HER2/neu), повышения апоптоза при старении не происходит. Низкий уровень апоптоза на поздних этапах онтогенеза является критическим для особи, и животные этой линии имеют значительно меньшую по сравнению с диким типом продолжительность жизни. Высокий канцерогенез у старых HER2/neu трансгенных мышей также является следствием супрессии р53-зависимого пути клеточной гибели.

ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Бажанова Е.Д., Данилова О.А., Черниговская Е.В., Бажанов И.А. Соотношение вазопрессин- и окситоцин-продуцирующей активности различных ядер гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системы // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1997. - Т. 33, № 2. - C. 199-204.

Бажанова Е.Д., Гриневич В.В., Данилова О.А., Черниговская Е.В. Изменение окситоцин(ОТ)-эргических нейросекреторных клеток (НСК) в добавочных крупноклеточных нейроэндокринных ядрах (ДЯ) гипоталамуса у крыс при старении // Морфология. - 1997. - Т. 111, N 2. - С. 44-46. Перевед. и опубл. в Neurosci Behav Physiol. 1998. 28(4):354-356, Bazhanova E.D., Grinevich V.V., Danilova O.A., Chernigovskaya E.V. 3. Age-related changes in oxytocinergic neurosecretory cells in the accessory magnocellular neuroendocrine nuclei of the hypothalamus in rats.

Бажанова Е.Д., Черниговская Е.В., Данилова О.А. Гипоталамическая регуляция функции коры надпочечников у старых и молодых крыс // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1998. - Т. 34, № 2.- C. 233-239.

Бажанова Е.Д., Черниговская Е.В., Данилова О.А., Бажанов И.А. Характеристика ядрышкового аппарата нейросекреторных клеток гипоталамуса у крыс разного возраста при острой иммобилизации животных // Цитология.- 1998.- Т. 40, № 4.- С. 248-255.

Черниговская Е.В., Бажанова Е.Д., Thibault J., Данилова О.А.. Участие моноаминергических клеток гипоталамуса в регуляции стрессорной реакции организма при старении. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. - 1999. - Т. 35, № 1.- С. 48-52.

Бажанова Е.Д. Роль апоптоза в развитии нервной системы млекопитающих // Усп. Совр. Биол. - 1999 – Т. 119, № 4.- С. 368-374.

Черниговская Е.В., Ямова Л.А., Бажанова Е.Д., Глазова М.В. Развитие NPY-ергической системы гипоталамуса крыс в ходе постнатального онтогенеза и ее участие в регуляции нонапептидергических нейросекреторных центров. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2000. – Т. 36, № 5, C. 461-464.

Bazhanova E.D., Chernigovskaya E.V., Danilova O.A. Different pathways of neurohormonal hypothalamic control of the adrenal cortex function in young and old rats // Mech Ageing Dev 2000 Sep 29;118(3):91-102.

Бажанова Е.Д., Жуков Д.А., Порта С., Данилова О.А. Влияние избегаемого и неизбегаемого стресса на уровни катехоламинов в надпочечниках и кортикостерона в плазме крови у молодых и старых крыс. // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2002. – Т. 38, № 2, C. 181-184.

Е.Д. Бажанова, Д.Л. Теплый. Влияние интерферона-aльфа на гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальную систему мышей при старении // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2003. – Т. 39, № 5, c. 482-487.

Е.Д. Бажанова, А.Н. Москвин, Г.Б. Белостоцкая, А.Г. Таранухин, Д.Л. Теплый. Реакция гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы на оксидативный стресс у мышей разного возраста // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2004. – Т. 40, № 1, 72-76.

Е.Д. Бажанова, Д.Л. Теплый. Участие интерферона-aльфа в регуляции апоптоза клеток гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы старых мышей при оксидативном стрессе // Морфология. - 2004. - Т. 125, N 1. – 23-26. Перевед. и опубл. в Neurosci. Behav. Physiol. 2005. 35(4):375-378, Bazhanova E.D., Teplyi D.L. Involvement of interferon-alpha in the regulation of apoptosis of cells of the hypothalamo-hypophyseal-adrenocortical system of aged mice in oxidative stress.

Е.Д. Бажанова. Участие интерферона-альфа в регуляции апоптоза // Журн. эволюц. биохимии и физиологии. – 2005. – Т. 41, № 2, 101-106.


загрузка...