Механизмы регуляции апоптоза в нейроэндокринной системе гипоталамуса в позднем онтогенезе (11.10.2010)

Автор: Бажанова Елена Давыдовна

Полученные нами данные указывают на то, что оксидативный стресс может вызвать развитие апоптоза НСК, и на одной из начальных стадий данного процесса синтезируется белок с-fos (Рис. 4В). Показано, что активность НСК и число апоптотических клеток в СОЯ молодых и старых мышей не изменяется при гипероксии, т.е., вероятно, оксидативный стресс не является специфическим для данного ядра. Однако кислород вызывает увеличение числа с-fos-ИР НСК в ПВЯ животных обеих возрастных групп.

Обнаружено, что НСК гипоталамуса синтезируют Инс/ИПП, выступающий как фактор выживания клеток, однако его содержание снижается в нейронах старых животных, коррелируя с активацией апоптоза (Рис. 5А). По литературным данным, инсулин/ИПП в нейронах, связываясь со своим мембранным рецептором, активирует PI3K/Akt–cAMP сигнальный путь, который может переключать внутриклеточные процессы, направляя текущий статус на метаболизм, клеточный рост и пролиферацию или апоптоз (Pertseva, 2005). Предупреждая апоптоз, Инс/ИПП способен индуцировать экспрессию Bcl-2 (Ueno et al., 1994) и подавлять активацию проапоптотических белков caspase-3 и Bad (Barber et al., 2001; Tseng et al., 2002). Итак, низкое содержание

Рис. 3. Микрофотография СОЯ старых мышей, окраска бромид этидия (апоптотические клетки), люминисцентная микроскопия, увел. х400.

Рис. 4. 4А Количество апоптотических НСК в СОЯ и ПВЯ. По оси У: проценты, М – молодые мыши, С – старые мыши. * - достоверность отличий по отношению к контролю, о – достоверность отличий между молодыми и старыми контрольными животными. То же для рис. 5-9. 4В Количество с-fos-ИР НСК в СОЯ и ПВЯ, По оси У: оптическая плотность.

Рис. 5. 5А Количество инсулин/ИПП-ИР материала в СОЯ и ПВЯ. 5В Количество вазопрессин-ИР материала в СОЯ и ПВЯ.

Рис. 6. Микрофотография ПВЯ молодых мышей. ИГХ реакция с антителами к Мcl-1, увел. х400.

Инс/ИПП в изучаемых НСК старых животных изменяет физиологический статус этих клеток, промотируя клеточную смерть. Снижение содержания Инс/ИПП, вероятно, может также приводить к зависимому от возраста уменьшению экспрессии с-fos в НСЦ (Рис. 4В). Снижение способности НСК активировать гены предраннего ответа (с-fos) в ответ на внеклеточные сигналы может быть одной из причин, приводящих к значительной потере нейронов СОЯ и ПВЯ при старении.

Взятые вместе, наши находки поддерживают предположение об апоптозе при старении как конечном пункте генетически программированного плана развития.

??????2

8Рис. 20). Это свидетельствует о тесной связи старения и апоптоза.

Изучено действие иммуномодуляторов на НСК гипоталамуса в онтогенезе.

Эффект ИА у старых животных проявляется усилением дистрофических процессов и снижением белкового синтеза в СОЯ и ПВЯ (Рис. 5). У молодых мышей не показано влияние ИА на НСЦ, но обнаружено увеличение количества апоптотических клеток в коре надпочечников. Сигнальный каскад апоптоза у молодых мышей при действии ИА идентичен в обоих ядрах, тогда как у старых мышей есть различия между СОЯ и ПВЯ (см. предлагаемую нами схему - Рис. 7). Эти различия могут быть связаны с возрастными изменениями, происходящими в ГГАКС интактных старых животных.

ИГХ исследование содержания ВП показало, что у молодых и старых контрольных мышей в клетках СОЯ ВП экспрессируется несколько интенсивнее, чем в ПВЯ (Рис. 5В). Была обнаружена тенденция к снижению содержания ВП в НСК обоих НСЦ при старении. ИА оказывает супрессорный эффект на синтез ВП, инсулина/ИПП (Рис. 5) и Bcl-2 (Рис. 8) в клетках молодых и старых мышей.

Рис. 7. Влияние ИА на функциональное состояние НСК и уровень апоптоза у молодых и старых мышей.

Рис. 8. Количество Bcl-2-ИР материала в СОЯ и ПВЯ. По оси У: оптическая плотность.

Обнаружено, что ИА не является протектором апоптоза нейронов гипоталамуса при старении, однако введение циклоферона, индуктора эндогенного интерферона, сопровождалось уменьшением уровня апоптоза у молодых и старых животных. Применение иммуномодуляторов перед стрессом снижает уровень апоптоза в НСЦ только у старых животных. Таким образом, участие иммуномодуляторов в регуляции программированной клеточной гибели зависит от стадии онтогенеза.

Участие гена TNF в механизмах апоптоза и старения НСК.

Проведенное исследование позволило изучить программированную клеточную гибель нейронов гипоталамуса TNF-нокаутных мышей, выявить зависимость апоптотического каскада от активации каспаз и оценить адаптивные возможности НЭС в позднем онтогенезе.

Мы показали, что уровень апоптоза НСК гипоталамуса молодых мышей не отличается у животных разных линий (TNF-/-, WT и белых беспородных), также как и динамика апоптоза в позднем онтогенезе (значительное повышение количества гибнущих нейронов, примерно одинаковое в СОЯ и ПВЯ, во всех группах мышей, максимальное у белых беспородных мышей) (Рис. 9).

Рис. 9. А Уровень апоптоза в НСЦ. Обозначения: По оси У: проценты, WT – мыши дикого типа (wild type), TNF-/- - TNF-нокаутные мыши, М – молодые мыши, С – старые мыши, МК – молодые белые беспородные мыши, СК - старые белые беспородные мыши, * - достоверность отличий по отношению к молодым животным, «WTC» - достоверность отличий по отношению к старым мышам дикого типа, «TNF-/-C» - достоверность отличий по отношению к старым TNF-нокаутным мышам. То же для последующих рисунков данной главы. В Апоптотические клетки в ПВЯ старой TNF-нокаутной мыши, окраска этидия бромидом, об.х40, увел. х400.

Различия в уровне caspase-8 в НСЦ, выявленные у молодых мышей разных линий, исчезают с возрастом, поскольку синтез caspase-8 при старении увеличивается во всех группах (Рис. 10А). Отмечено, что в НСЦ старых животных содержание caspase-8 коррелирует с уровнем апоптоза в изученных группах мышей (Рис. 10А). Можно предположить, что в отсутствие TNF активация caspase-8 осуществляется другими факторами, например, через FAS-ligand, IL-6, р53 и тд. Таким образом, можно заключить, что интенсификация апоптоза при старении не зависит от гена TNF, и апоптоз при старении является каспазо-зависимым.

Не было выявлено активации caspase-9 при старении, влияние возраста либо отсутствовало (TNF-нокаутные мыши), либо выражалось в снижении уровня данного показателя (WT) (Рис. 10В). В настоящее время описаны 2 каспазо-зависимых пути апоптоза, один из них, инициируемый извне, идет посредством активации caspase-8 рецепторами клеточной поверхности, другой, внутренний, связан с освобождением цитохрома с, последующей активацией APAF1 и, далее, caspase-9 (Madden et al., 2007). Результаты нашего исследования показывают, что при старении в НСК мышей активируется внешний путь клеточной гибели, c участием поверхностно-клеточных рецепторов. Причиной активации данного пути апоптоза может быть любой генотоксический стресс, например, оксидативный - как известно, при старении значительно повышается уровень перекисного окисления липидов (Ishii, 2007).

Рис. 10. 10А Содержание caspase-8-ИР материала в НСЦ. Обозначения: «WTM» - достоверность отличий по отношению к молодым мышам дикого типа, «TNF-/-М» - достоверность отличий по отношению к молодым TNF-нокаутным мышам. 10В Содержание caspase-9-ИР материала в НСЦ.

Для определения путей регуляции программированной клеточной гибели мы исследовали экспрессию белков семейства Bcl-2 (Bcl-2, Mcl-1, Bax) в НСК. Синтез проапоптотического белка Вах в НСК можно оценить неоднозначно: примерно одинаковый уровень у молодых животных всех линий и значительные отличия при старении (повышение в СОЯ во всех группах, снижение в ПВЯ (WT) или отсутствие изменений (TNF-/-, нелинейные мыши)) (Рис. 11А). Ранее нами было показано, что в активации возраст-зависимого апоптоза имеет значение соотношение Вах с другими членами семейства Bcl-2 (Bcl-2, Mcl-1) (Бажанова и др., 2006; Молодцов и др., 2006). Несмотря на уменьшение количества проапоптотического белка Вах в ПВЯ, снижения уровня апоптоза не происходит, вероятно, за счет активации каких-либо других белков-индукторов апоптоза (предположительно р53), и интенсивно экспрессирующейся caspase-8.

В отношении антиапоптотического белка Bcl-2 нужно отметить, что изменения его при старении (возрастание в СОЯ и снижение в ПВЯ) наблюдались только у нелинейных мышей (Рис. 11В). Примерно так же можно

Рис. 11. Содержание Вах-ИР (11А), Bcl-2-ИР (11В), Mcl-1-ИР (11С), ВП-ИР (11D) материала в НСЦ. Обозначения: «wtM» - достоверность отличий по отношению к молодым мышам дикого типа, «TNF-/-М» - достоверность отличий по отношению к молодым TNF-нокаутным мышам.

охарактеризовать и изменения при старении уровня другого антиапоптотического белка, Mcl-1: повышение синтеза в СОЯ старых мышей всех изученных групп и отсутствие изменений (WT, TNF-/-) или даже снижение (нелинейные мыши) в ПВЯ (Рис. 11С). В сравнении с возрастающим при старении уровнем апоптоза НСК это говорит о том, что протекторная функция антиапоптотических белков-членов семейства Bcl-2 на поздних этапах онтогенеза снижается, и эти белки уже не могут уменьшить число гибнущих нейронов (Рис. 11А-С).

Таким образом, одной из причин апоптоза в СОЯ при старении является повышение уровня проапоптотического белка Вах во всех изученных группах животных, в ПВЯ – дисбаланс синтеза белков семейства Bcl-2 (Рис. 11А-С).

Содержание ВП в НСК является важным морфофункциональным критерием НЭС. По нашим данным, уровень ВП у молодых нелинейных мышей значительно выше, чем у TNF-нокаутных и WT животных (Рис. 11D). При старении у белых беспородных мышей количество ВП в НСК гипоталамуса не изменялось. Однако даже повышение содержания данного нейрогормона у старых мышей TNF-/- и WT не позволяет достигнуть уровня ВП у нелинейных животных (Рис. 11D).

В своих исследованиях мы показали отсутствие изменений ВП на поздних этапах онтогенеза у мышей линии SHR (Молодцов и др., 2006), и повышение синтеза его у HER2/neu (Бажанова и др., 2007, 2009) и крыс Wistar (Бажанова и др., 1996). Другими авторами была выявлена активация синтеза ВП у людей после 80 лет и у старых крыс (Fliers et al., 1985). Можно заключить, что экспрессия ВП в гипоталамусе примерно одинакова в разных НСЦ (СОЯ и ПВЯ), и зависит от возраста и генотипа животного.

Таким образом, в нашей работе впервые показана динамика апоптоза НСК в онтогенезе TNF-/- мышей, рассмотрен сигнальный каскад клеточной гибели при отсутствии TNF?, и произведена оценка функционального состояния (уровень вазопрессина) НЭС мышей разных генетических линий. Выявлена интенсификация синтеза ВП при старении у животных обеих линий. Мы показали, что при старении наблюдается активация апоптоза НСК, и отсутствие гена TNF не влияет на активность данного процесса. Результаты проведенного исследования показывают, что при старении в НСК мышей активируется внешний путь клеточной гибели, c участием поверхностно-клеточных рецепторов и caspase-8, а также р53-зависимый путь. Сигнальные пути, опосредующие клеточную гибель в разных НСЦ при старении, различны. Так, в СОЯ Вах играет определяющую роль в индукции апоптоза НСК при старении во всех изученных группах животных. В ПВЯ большее значение имеет снижение антиапоптотической защиты. Таким образом, дисбаланс синтеза белков семейства Bcl-2 играет важную роль в развитии старческого апоптоза.

Участие гена HER2/neu в механизмах апоптоза и старения НСК.

Онкопротеин HER2/neu играет важную роль во многих процессах, в том числе в канцерогенезе (Sunpaweravong and Sunpaweravong, 2005; Nagy et al., 1999). Онкогенные характеристики HER2/neu связаны с влиянием на различные апоптотические пути в клетках, сверхэкспрессирующих этот белок (Sabbatini et al., 1999; Nagy et al., 1999; Zhou et al., 2000). Целью данного этапа работы было изучить изменения в регуляции процесса апоптоза, вызываемые сверхэкспрессией HER2/neu, в НСК гипоталамуса HER2/neu трансгенных мышей при старении. Мы исследовали экспрессию апоптотических сигнальных белков в сравнении с уровнем апоптоза и функциональной активностью в НЭС. Кроме того, определяли уровень 17?-эстрадиола в плазме крови, как одного из возможных антиапоптотических факторов, активных в нейронах.

Мы обнаружили, что при старении у данных мышей не наблюдается активации апоптоза НСК, в отличие от животных дикого типа (Рис. 12-14). Таким образом, впервые было показано, что сверхэкспрессия HER2/neu достаточна для защиты от возраст-зависимой активации апоптоза в НСЦ. Эти находки предполагают, что HER2/neu сверхэкспрессия активирует мощные антиапоптотические механизмы. В поисках причин такой устойчивости к возраст-зависимому апоптозу мы проанализировали экспрессию ряда ключевых апоптоз-регулирующих молекул.

В наших экспериментах показано увеличение экспрессии р53 при старении в нейронах гипоталамуса, коррелирующее с повышением уровня апоптоза, у мышей дикого типа. Однако у старых трансгенных животных уровень апоптоза оставался низким, так же как и синтез р53 (Рис. 15А,C,D). Мы предположили, что возможной причиной подавления возраст-зависимой активации апоптоза может быть супрессия р53-опосредуемого сигнального пути на уровне регуляторов р53. Результаты наших исследований показали, что наиболее уязвимой точкой этого каскада при сверхэкспрессии HER2 является WRN (Рис. 15В). Недостаточная экспрессия WRN может нарушать взаимодействие с р53, тем самым подавлять его синтез и функционирование. Вероятно, это является причиной преждевременного старения и повышенного канцерогенеза данной линии мышей (уровень заболеваемости у старых мышей линии HER2 составляет 100%, наиболее часто встречающейся опухолью у старых мышей HER2 является аденокарцинома, число их на одно животное составляет 4,7). Кроме того, мы предполагаем, что, несмотря на повышение количества белка WRN при старении, функция его значительно снижена, т.к., помимо wild-type WRN, могут экспрессироваться и дефектные формы этого белка.

Выявлено, что регуляция апоптоза в различных ядрах опосредуется разными сигнальными путями. Так, у старых мышей SHR мы наблюдали активацию р53-зависимого пути в СОЯ и ПВЯ (Рис. 15А,C,D). При этом имело место повышение экспрессии caspase-8 в НСЦ старых мышей SHR (Рис. 16D). У трансгенных мышей, очевидно, сверхэкспрессия HER2/neu блокировала

Рис. 12. TUNEL-позитивные клетки в СОЯ и ПВЯ мышей SHR и HER2+/+. А - по оси У: число апоптотических клеток на срез ядер; Обозначения: М – молодые мыши, С – старые мыши, * - достоверность отличий по отношению к контролю, о – достоверность отличий между молодыми и старыми контрольными животными, те же обозначения для последующих рисунков. В - микрофотография ПВЯ старой мыши, увел. х400.

Рис. 13. Клетки, окрашенные бромидом этидия (апоптотические клетки-обведение) в СОЯ и ПВЯ мышей SHR и HER2+/+. С - по оси У: доля апоптотических клеток на срез ядер в процентах. D - микрофотография ПВЯ старой мыши, увел. х400.

Рис. 14. Клетки, окрашенные бромидом этидия в ПВЯ мышей SHR и HER2+/+. Стрелками отмечены апоптотические клетки; люминисцентная микроскопия, увел. х400. 14c микрофотография ПВЯ старых мышей HER2/neu, 14d микрофотография ПВЯ старых мышей SHR.

значительное количество всех апоптотических путей, независимо от возраста животного (Рис. 12, 13).


загрузка...