НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОДИАГНОСТИКИ И МЕХАНИЗМЫ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА (11.07.2011)

Автор: Афанасьев Максим Станиславович

Rf 5'- TAGCCAATCATTGTAAACA-3' 321 п.н.

Генотип D Domp f 5'-ATAATGAGAATCTAAAGACG-3'

Domp r 5'-TAGAATGAGCATATTGGCAA-3' 174 п.н.

Генотип K Komp f 5'-TGTTCTTAACACAGCTTTGGA-3'

Komp r 5'-AGGTATAGATTGAGCGTATTGG-3' 150 п.н.

Генотип G Gomp f 5'-AGAGTAGTCGCAGCGAAC-3'

Gomp r 5'-ACTGTAACGGCGTATGTG-3' 146 п.н.

Генотип A Aomp f 5'-AATACAGTATTCTGGCTTAGAT-3'

Aomp r 5'-TGACTGAATGCAGGGTTGGGA-3' 57 п.н.

Генотип B Bomp f 5'-AGTTCGAGAGTATCTTTGATGTT-3'

Bomp r 5'-TCTGCGCTAGTTATCATTATCG-3' 75 п.н.

Ch. trachomatis осуществляли с помощью ПЦР, применяя специфические сконструированные оригинальные олигонуклеотидные праймеры, ориентированные к вариабельным участкам VS1–VS4 гена ompA Ch. trachomatis (табл. 1). Первоначально проводили амплификацию с использованием специфических праймеров к группам генотипов, далее с использованием специфических праймеров к определенному генотипу группы.

Анализ антибиотикорезистентности штаммов Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae проводили с помощью ПЦР с использованием подобранных оригинальных праймеров с целью выявления генов устойчивости к тетрациклинам (tet-M и tet-O) и макролидам (erm): Tet-f: 5'-AGYTTCCACCGAAYTCCTTTC-3' и Tet-r: 5'-ATACACCGAGCAGGGATTTC-3' (размер продукта амплификации 470 пар нуклеотидов); Erm-f: 5'-AAGCCAYTGCGTCTGACATC-3' и Erm-r: 5'-TGGCGTGTTTCATTGCTTGA-3' (размер продукта амплификации 300 пар нуклеотидов).

Цитологический метод (диагностика хламидиоза)

Забранный материал из Цк, Вл, Ур, задней стенки глотки в виде мазков-соскобов наносили на обезжиренные предметные стекла, высушивали на воздухе и фиксировали не менее 15-ти минут в 96? этиловом спирте для последующей окраски и микроскопии. Окраску мазков проводили по Романовскому-Гимзе и раствором Люголя, согласно общепринятой методике (Савичева А.М., 2004). Учет результатов осуществляли на световом микроскопе «Микмед 5» при увеличениях *100, *400, *1000. Проводили также окрашивание меченными моноклональными антителами (тест-система CeLLabs, Австралия) для выявления антигенов Ch. trachomatis и Chl. pneumoniae в реакции ПИФ (для Ch. trachomatis) и НИФ (для Chl. pneumoniae). Учет результатов осуществляли на люминесцентном микроскопе «Micros» (Австрия) при увеличении *600. Хламидии в препаратах выявлялись в виде характерных цитоплазматических включений, окрашенных в соответствующий методу цвет. Мазки-соскобы также исследовали ПЦР-методом.

Серологический метод (диагностика хламидийной инфекции)

Выявление Ат к Ch. trachomatis осуществляли в сыворотке крови человека и обезьян с помощью ИФА (Бакулев А.Л. и др., 2008; Савичева А.М., 2002). Выявление Ат иммуноглобулинов (Ig) классов IgA и IgG к Ch. trachomatis проводилось на тест-системах Ch. trachomatis-IgA-pELISA medac и Ch. trachomatis-IgG-pELISA medac (Германия). Положительным результатом считали содержание IgA-Ат ?1:50, IgG-Ат ?1:50. Выявление Ат к белку теплового шока (БТШ) проводилось с использованием иммуноферментного тест-набора для определения IgG-Ат к хламидийным белкам теплового шока 60 cHSP60-IgG-ELISA medac (Германия). Положительный результат оценивался при содержании IgG-Ат ? 1:50. Постановку реакций проводили в соответствии с инструкциями по применению, прилагаемых производителем.

Культуральный метод (диагностика хламидиоза)

Соскобным материалом, полученным из УГТ, инокулировали суточную культуру клеток McCoy, выращенную на покровных стеклах, помещенных в лунки 24-луночных планшет (Савичева А.М., 2002; Савичева А.М., 2004). Центрифугирование после инокуляции проводили при 1000 об/мин в течение 1 часа. Контроль развития хламидийной инфекции осуществляли путем микроскопирования клеток в инвертированном микроскопе «ЛОМО» (Россия). Покровные стекла окрашивали по Романовскому-Гимзе, раствором Люголя или меченными моноклональными антителами для выявления антигенов хламидий в реакции ПИФ и непрямой иммунофлуресценции НИФ (тест-система CeLLabs, Австралия). Титрование хламидий осуществляли стандартным методом по цитопатическому действию (Павлович С.А., 2008). Детекцию возбудителя в инфицированных клетках культуры проводили также с помощью ПЦР.

Иммунологические методы исследования

Забор ЦС проводили с помощью стерильного урологического зонда. Зонд немедленно погружали в пробирку типа «Эппендорф», содержащую 0,5 мл физиологического раствора. К каждому образцу после взвешивания добавляли равное весовое количество физиологического раствора, после чего смесь тщательно перемешивали в течение 10 минут на шейкере. Образцы хранили при температуре минус 50(С не более трёх месяцев. Определение общего белка проводили согласно инструкции к «Набору по определению общего белка в моче ФС» ("Диакон Диагностика", г. Москва).

Смыв со стенок влагалища проводили следующим образом: 5,0 мл 6,0% раствора полиглюкина вливали во влагалище, оставляли на 10 минут, затем проводили аспирацию всей жидкости из влагалища. Полученный секрет тщательно перемешивали и затем помещали в пробирки типа «Эппендорф». Образцы хранили при температуре минус 50 (С.

Определение иммуноглобулинов в ЦС и смыве из Вл женщин

Иммунологическое исследование включало определение концентрации в ЦС IgG, IgМ, IgА, sIgА и свободного sc методом радиальной иммунодиффузии РИД (Чернохвостова Е. В. И др., 1987).

Определение цитокинов в ЦС женщин

Содержание в слизи Цк IL-1?, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-?, TNF-?, ГМ-КСФ цитокинов оценивали методом проточной флюориметрии на двух лучевом лазерном автоматизированном анализаторе ("Bio-plex Protein Assay System", Bio-Rad, USA) с использованием коммерческих тест-систем 10-Plex (определяемый динамический диапазон 2-32000 пкг/мл) в соответствии с инструкцией фирмы-производителя.

Статистическая обработка полученных данных

Математическую обработку полученных данных проводили в рамках параметрической и непараметрической базовой статистики с использованием критерия Стьюдента, метода (2, коэффициента ранговой корреляции Спирмена (при rs ?0,7 связь считали сильной; при 0,5?rs<0,7 связь являлась средней; при rs <0,5 связь считали слабой; при rs=0 – линейная связь отсутствует), применяя стандартный пакет статистических программ Microsoft Excel 2007.

Морфологический, культуральный, серологический, микробиологический, иммуноцитологический, молекулярно-генетические методы исследования проводились на лабораторной базе ФГУН МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского Роспотребнадзора. Молекулярно-генетическое типирование штаммов хламидий проводилось на базе Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск, Московской области).

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследованием на наличие уреаплазм выявлен высокий титр возбудителя – > 104 КОЕ/мл – у 100% больных. Установлены у 6 больных уреаплазменная моноинфекция и у 44 больных – сочетанный характер инфицирования. При микст-инфекциях наблюдалось образование 2-7-компонентных ассоциаций патогенных агентов.

Таблица 2. Нарушение микробиоценоза влагалища в группе больных уреаплазмозом до лечения (50 пациенток)

Показатели Степень нарушения микробиотопа влагалища

Промежуточный тип, n=5* Дисбиоз, n=22** Бактериальный вагинит, n=64***

Номера столбцов 1 2 3 4

Степень чистоты мазка: II, n=5 III, n=22 III, n=5 IV, n=18

Морфология мазка:

обсеменённость эпителиоцитов 38,2+8,2 78,2+14,3 90,4+20,3 154,7+27,2

лейкоциты 16,2+2,4 34,6+4,2 39,8+7,2 52,6+7,4

ключевые клетки 0 3,2+0,3 5,2+1,3 5,8+0,6


загрузка...