НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ ИММУНОДИАГНОСТИКИ И МЕХАНИЗМЫ ИММУННЫХ НАРУШЕНИЙ ПРИ УРОГЕНИТАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У ЖЕНЩИН РЕПРОДУКТИВНОГО ВОЗРАСТА (11.07.2011)

Автор: Афанасьев Максим Станиславович

2.Выявить патогенетический, диагностический и прогностический потенциал микробиоценозов урогенитального тракта женщин при хламидийной и уреаплазменной инфекциях.

3.Оценить роль рецепторов врождённого иммунитета в патогенезе, а также диагностическое и прогностическое значение регистрации показателей их уровней при урогенитальной хламидийной инфекции женщин.

4.Изучить колонизационную резистентность слизистой цервикального канала при урогенитальной хламидийной инфекции.

5.Установить клинико-диагностические и прогностические возможности выявления фенотипических и генотипических (серологических) особенностей возбудителя при урогенитальной хламидийной инфекции.

Научная новизна работы

Впервые показано, что выраженный длительный вторичный иммунодефицит является неотъемлемой частью патологических проявлений при урогенитальных хламидийной и уреаплазменной инфекциях, на организменном уровне проявляющийся повышенной восприимчивостью к бактериальным и вирусным агентам, высокой частотой выявления воспалительных процессов гениталий; на местном уровне (слизистые) – относительно слабо выраженной воспалительной реакцией, дисбаллансом в цитокиновом и иммуноглобулиновом звеньях, угнетением нормофлоры (лактобациллы и бифидобактерии), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, что в сочетании способствует нарушению колонизационной резистентности слизистых как основного компонента мукозального иммунитета.

Впервые комплексно оценена просветная и пристеночная микрофлора влагалища и показатели иммуноглобулинов секрета влагалища клинически здоровых женщин и пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией. Выявлено резкое снижение колонизационной резистентности, характеризующееся появлением и/или значительным увеличением в просветной и пристеночной областях ассоциаций условно-патогенных факультативно (стрептококки, стафилококки, энтерококки, энтеробактерии, кандида)- и облигатно-анаэробных микрооганизмов (пептострептококки, пептококки, гарднереллы, бактероиды, фузобактерии) и изменением показателей иммуноглобулинов секрета влагалища у пациенток с уреаплазменной микст-инфекцией, по сравнению с клинически здоровыми.

При хламидийной инфекции микроорганизмы, попадая на слизистые УГТ, взаимодействуют с рецепторами врождённого иммунитета и запускают воспалительную реакцию. Различные уровни активации рецепторов TLR-2 и TLR-4 зависят от качественного состава микробных сообществ, присутствующих на слизистой оболочке УГТ. Показатели уровней обсеменённости УПМ Цк, Ур и Вл прямо коррелировали с показателями уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4. Низкие уровни экспрессии генов TLR-4 при осложненном инфекционном процессе свидетельствуют о переключении TLR-4 типа иммунного ответа на TLR-2. Повышение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4, как в Цк, так и в Ур, коррелирует с тяжестью клинических проявлений, зависящей как от хламидий, так и от ассоциатов (возбудителей ИППП и УПМ). Во Вл имеет место экспрессия генов TLR-2 и TLR-4 в ответ на УПМ, а в Цк и Ур – на УПМ и ИППП. Активация экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 происходит более выраженно в ответ на УПМ и менее выражено при контакте с нормофлорой.

Впервые установлена определяющая роль TLR-2 и TLR-4 слизистых нижних отделов урогенитального тракта в ответе макроорганизма на инфицирование хламидиями при урогенитальном хламидиозе. Естественная или приобретённая супрессия генов TLR-2 и TLR-4 обусловливает хроническое течение УГХ. При воспалении шейки матки/уретры более чем у половины женщин с хроническим рецедивирующим течением УГХ наблюдается снижение экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 (в полтора-два раза ниже значений у клинически здоровых пациентов), сопровождаемое уменьшением лейкоцитарной реакции. Как про-, так и антиапоптозная активности хламидий определяют характер развития инфекции: продуктивная инфекция либо персистенция.

Выявленные однотипные изменения показателей уровня экспрессии TLR-2 и TLR-4 в Цк и Ур пациенток с хронической формой хламидийной инфекции указывают на развитие "феномена рецепторной депрессии", сопровождающегося дисбалансом между развитием инфекционного процесса и воспалительной реакции. Уровни экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 служат критериями оценки выраженности хламидийной инфекции и наличия воспалительного процесса у больных, а при выздоровлении их снижение может свидетельствовать об эрадикации возбудителя. При острой хламидийной инфекции выявление низких уровней TLR-2 и TLR-4 указывает на возможность начала хронизации инфекционного процесса.

Впервые выявлена при УГХ в УГТ взаимосвязь рецепторов врождённого иммунитета TLR-2 и TLR-4 (контролируют запуск цитокинового каскада местной антиинфекционной резистентности, через который запускаются иммуноглобулиновое звено и воспалительная реакция) с микрофлорой биотопа (в том числе, с нормофлорой) определяет колонизационную резистентность слизистых и характеризует течение инфекционного процесса, выраженность клинических и лабораторных проявлений и исход заболевания (излечение, хронизация), а оценка их уровней носит диагностический и прогностический характер.

При хламидийной инфекции впервые выявлена зависимость выраженности патологического процесса и клинических проявлений от наличия и сочетания отдельных патогенетических факторов (плазмиды, функциональное состояние гена IncA, принадлежность штамма хламидий к конкретному генотипу, одновременное инфицирование штаммами хламидий с разными генотипами и возможность обменивания между ними генетической информацией с появлением другой разновидности хламидийного штамма).

Теоретическая значимость работы

Впервые показано, что взаимодействие микробиоценозов слизистых урогенитального тракта и макроорганизма носит динамический характер, обеспечивает жизненно необходимый оптимальный уровень реактивности макроорганизма. Тем самым, достоверно подтверждена роль микроорганизмов в обучении защитных систем макроорганизма в динамике онтогенеза. Формирование вторичного иммунодефицита является неотъемлемым патогенетическим фактором инфекционного процесса, обусловливающего, в конечном счёте, прогноз и исход заболевания.

Впервые выявлено, что взаимодействие микроорганизмов биотопов слизистых, а также возбудителей инфекционных заболеваний с рецепторами врождённого иммунитета является необходимым фактором запуска инфекционного процесса.

Впервые представлена колонизационная резистентность как неотъемлемая часть мукозального иммунитета.

Впервые показано влияние фенотипических и генотипических свойств возбудителя на выраженность патогенетического процесса, клинических проявлений при хламидийной урогенитальной инфекции.

Практическая значимость работы

Получен патент РФ «Способ оценки микробиоценоза влагалища» № 2249821. Зарегистрирован 10.04.2005. Предложена новая медицинская технология «Оценка микробиоценоза влагалища при инфекционных и других заболеваниях женской половой сферы», утверждена Минздравсоцразвитием: Разрешение на применение новой медицинской технологии. Серия АА. № 0001997. ФС № 2009/187 от 17.07.2009. Разработаны и предложены лабораторные критерии диагностики урогенитального хламидиоза с установлением острой и хронической рецидивирующей формы заболевания, защищённые Патентом РФ «Способ диагностики хронического урогенитального хламидиоза» №2327995. Зарегистрирован 27.06.2008 г. На разработаный способ мультиплексной ПЦР диагностики хламидийной инфекции обезьян, вызванной видом Chlamydophila pneumoniae и Chlamydia trachomatis, и способ мультиплексной ПЦР диагностики плазмидных и бесплазмидных штаммов вида Chlamydia trachomatis, получен Патент РФ «Способ диагностики хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385946, зарегистрирован 10.04.2010, (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений России») и Патент РФ «Способ прогнозирования манифестной или стертой формы хламидийной инфекции человека или обезьян и набор для его осуществления» № 2385945, зарегистрирован 10.04.2010 (награждён Федеральной службой по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Дипломом в номинации «100 лучших изобретений Росси»).

Положения, выносимые на защиту

Хламидийная и уреаплазменная инфекции сопровождаются развитием длительного вторичного иммунодефицита. Последний наиболее выражен при урогенитальном хламидиозе и проявляется на местном уровне относительно слабо выраженной воспалительной реакцией при остром и обострении хронического хламидиоза, угнетением нормофлоры (лактобацилл и бифидобактерий), сниженной реакцией на условно-патогенную микрофлору, а в дальнейшем развитием у переболевших кольпита, эрозии шейки матки, сальпингоофорита.

Изменения уровней микробиологических и иммунологических показателей биотопа влагалища отражают патогенетические механизмы при хламидийной и уреаплазменной микст-инфекциях и могут быть диагностическими и прогностическими показателями течения инфекционного процесса.

Впервые установлена диагностическая и прогностическая значимость оценки уровней экспрессии генов TLR-2 и TLR-4 при урогенитальном хламидиозе у женщин. Воспалительная реакция и реакция слизистых урогенитального тракта на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, колонизационная резистентность координируются TLR-2 и TLR-4.

Впервые описан алгоритм запуска колонизационной резистетности слизистой цервикального канала: TLR слизистых реагируют на условно-патогенную микрофлору и нормофлору, через цитокиновую систему запускают местную воспалительную реакцию, определяют уровни IgG, sIgA и секреторного компонента (sc), что в комплексе и определяет колонизационную резистентность.

Впервые доказана связь генотипических и фенотипических свойств возбудителей с патогенетическими механизмами и особенностями клинического течения урогенитальной хламидийной инфекции.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты исследований и разработок используются в научных исследованиях кафедры клинической аллергологии и иммунологии Первого Московского государственного медицинского университета имени И.М. Сеченова.

Апробация работы

Материалы исследования и основные положения работы доложены на заседании совместной научной конференции кафедры клинической иммунологии и аллергологии факультета последипломного профессионального образования врачей и кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии медико-профилактического факультета Первого Московского государственного медицинской университета им. И.М. Сеченова 25 февраля 2011 года, на XIII Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006 г.), на XIV Российском Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007 г.), на XV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.), IV международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербурского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (Санкт-Петербург, 2-4 июня 2008г.), Всероссийской научно-практической конференции «Современные представления об иммунокоррекции» (Пенза, 2-3 октября 2008г.), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 6-10 апреля 2009г.), Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 21-22 апреля 2009г.), The 3rd Congress of European Microbiologists «Microbes and Man – interdependence and future challenges» (Gothenburg, Sweden, June 28-July 2, 2009), XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 11-15 апреля 2011г.).

Личный вклад автора

Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, автором лично проведено моделирование процессов, мониторинг основных параметров, аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической клинико-иммунологической и клинико-бактериологической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах и их внедрения в практику.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 48 научных работ, из них 24 публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определённых ВАК, 4 патента РФ на изобретения.

Структура и объём диссертации

Работа изложена на 230 страницах текста, иллюстрирована 23 таблицами, 16 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов исследования, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, содержащего 355 источников, в том числе 131 отечественных и 224 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 50 женщин в возрасте 18-36 лет, с установленной уреаплазменной моно- и микст-инфекцией. U. urealiticum выявлялась у всех больных в диагностическом титре более чем 104 КОЕ/мл. Контрольная группа (группа сравнения) включала 40 клинически здоровых женщин.

Клинико-анамнестические и лабораторные данные 228 больных с УГХ позволили отобрать 100 пациенток и 32 клинически здоровых женщин, которые были разбиты на 4 группы. Группу I составила 41 пациентка. Положительные результаты ПИФ, ПЦР и культурального посева подтверждали наличие Ch. trachomatis в УГТ. В сыворотке крови данных больных в ИФА определялись IgG-Ат в титре 1:50-100. Повторный лабораторный анализ на наличие антител (через 2-3 недели) показал появление IgМ-Ат (в титре 1:50 и выше), что свидетельствовало о первичном инфицировании больных и острой стадии инфекционного заболевания. Пациентки отрицали наличие ранее перенесенного хламидиоза. Группу II составляли 29 пациенток. В сыворотке крови определялись стойкие титры IgА-Ат (1:100-1:200) и IgG-Ат (1:100-1:200), концентрация которых не изменялась на протяжении длительного периода. Длительность заболевания составляла от 3 до 5 лет. Положительные результаты ПИФ, культурального посева и ПЦР свидетельствовали о лабораторно подтверждённом рецидиве УГХ. Схожесть клинических проявлений и наличие двух эпизодов обострения заболевания в течение предшествующих 12 месяцев свидетельствовали о хроническом течении хламидийной инфекции. Рецидивы отмечались с частотой 1 раз в полгода. Все больные неоднократно получали антибактериальную терапию, однако не наблюдалось стойкого клинического и бактериологического положительного эффекта. В группу III (группа сравнения) вошли 30 пациенток, в анамнезе которых ранее диагностировался УГХ. Отсутствие IgА-Ат и низкие, не меняющиеся во времени титры IgG-Ат (1:50) свидетельствовали о давно перенесённой хламидийной инфекции. Об этом свидетельствовали и IgG-Ат в титрах 1:100-200, уровни которых снижались в течение 12 месяцев. Маркёры хламидий в УГТ не выявлялись ни одним из использованных методов диагностики в течение одного года. В группу IV (контрольная, группа сравнения) включили 32 клинически здоровые женщины. Клинико-лабораторное обследование подтвердило отсутствие признаков хламидийной инфекций и ИППП, а также наличия гинекологической патологии. Возраст обследованных пациенток варьировал от 20 до 39 лет.

Дополнительно проведено клинико-лабораторное обследование 99 пациентов с подозрением на хламидиоз и 39 клинически здоровых пациентов.


загрузка...