Итерлейкин-18: биологические эффекты и перспективы клинического применения (11.01.2012)

Автор: Якушенко Елена Владимировна

Примечание: Мыши СBF1 получали к стандартному рациону трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь в течение 16 дней. Клетки селезенки культивировали без или в присутствии КонА (5мкг/мл) 48 часов. ИФН-? определяли в супернатантах методом ЭХЛ. Данные представлены как медиана и размах квартилей. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, нами было выявлено влияние моркови, несущей ген ИЛ-18, на продукцию спленоцитами мыши регуляторного цитокина ИФН?, что свидетельствует о наличии специфических для ИЛ-18 иммуномодулирующих свойств трансгенной моркови при пероральном применении.

Установлено, что добавление в пищу трансгенной моркови (в дозе 1,7-2 гр/мышь/сут) в течение 16 дней достоверно стимулирует выраженность ГЗТ по сравнению с интактной и контрольной группами. При изучении формирования гуморального иммунного ответа не выявлено достоверного влияния перорального применения трансгенной моркови с ИЛ-18 на уровень первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген (эритроциты барана) (данные не представлены). Трансгенное растение, несущее ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении оказывает действие аналогичное рекомбинантному белку, то есть увеличивает продукцию ИФН? иммунокомпетентными клетками и стимулирует выраженность реакции ГЗТ, что отражает влияние этого продукта на формирование клеточного иммунного ответа.

Для изучения противоопухолевых свойств трансгенного растения, несущего ген ИЛ-18, использовалась модель уретан-индуцированной аденокарциномы легких. В наших опытах показано, что употребление в пищу моркови, несущей ген ИЛ-18, приводит к достоверному уменьшению числа аденоматозных узлов у опытной группы по сравнению с контрольной и интактной группами, а также снижению среднего диаметра аденом у опытной и контрольной групп мышей по сравнению с интактной (рисунок 18).

Поскольку данная модель аденомы легких является истинной опухолью и может служить моделью доброкачественного и злокачественного процесса ?Bentel J.M., 1989?, мы предполагаем, что ИЛ-18 человека, продуцирующийся в клетках трансгенного растения, может оказывать противоопухолевое действие через механизмы, описанные в литературе, а именно стимуляцию экспрессии FasL, увеличение цитотоксичности Т- и НК-клеток, ингибирование ангиогенеза, стимуляцию продукции иммунорегуляторных цитокинов и др. Кроме того, возможный механизм действия генетически модифицированной моркови, несущей ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении может осуществляться через иммунокомпетентные клетки слизистой кишечника.

Рис.18. Влияние перорального применения трансгенной моркови, экспрессирующей ген чИЛ-18 на опухолевый процесс в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

Примечание: Мыши линии BALB/c получали трансгенную или обычную морковь в дозе 1,7-2 гр/мышь 16 дней ежедневно, и 2 месяца по 3 раза в неделю. Через 4 месяца легкие фиксировали в 10% формалине и проводили подсчет количества и измерение диаметра аденоматозных образований при помощи бинокулярной лупы. Данные представлены как медиана и размах квартилей. n=36. На рисунке стрелками обозначены статистически достоверные различия при р<0,05.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что трансгенная морковь, несущая ген ИЛ-18 человека, при пероральном применении обладает активностью, схожей с рекомбинантным белком, в частности, стимулирует продукцию ИФН? иммунокомпетентными клетками и реакцию ГЗТ, а также проявляет противоопухолевую активность в модели уретан-индуцированной аденокарциномы легких.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, в результате проведенных исследований нами показано, что рекомбинантный ИЛ-18, полученный по оригинальной методике, обладает иммунорегуляторной активностью, стимулируя продукцию ИФН? и ФНО мононуклеарными клетками периферической крови, увеличивая выраженность реакции гиперчувствительности замедленного типа. Рекомбинантные ИЛ-18 и его антагонист ИЛ-18 связывающий белок обладают противоопухолевой активностью, но в разных моделях. Так, рИЛ-18 при внутривенном введении уменьшает вес солидной опухоли меланомы В16 и продолжительность жизни мышей, а ИЛ-18СБ уменьшает количество опухолевых очагов в гематогенной метастатической модели меланомы В16, что свидетельствует о разных механизмах подавления опухолевых процессов для указанных белков и целесообразности их применения в цитокиновой и антицитокиновой терапии онкопатологии. ИЛ-18 также эффективен при использовании в клеточных технологиях для активации функций клеток-эффекторов противовирусного и антибактериального иммунного ответа. Кроме того, ИЛ-18 может участвовать в механизмах несостоятельности иммунного ответа при хронизации и прогрессии гепатита В, поскольку уровень продукции эндогенного ИЛ-18, являющегося одним из активных участников противовирусной защиты, связан с аллельными вариантами его гена, что может отражаться на формировании эффективного иммунного ответа у каждого конкретного индивида. При исследовании эффективности перорального использования генетически модифицированного растения моркови, несущей ген ИЛ-18 человека, показана принципиальная возможность использования этого продукта для стимуляции реакций клеточного иммунного ответа. Таким образом, рИЛ-18 является одним из перспективных иммунорегуляторных факторов для применения как в цитокинотерапии иммуноопосредованных заболеваний, так и в клеточных технологиях.

ВЫВОДЫ:

1. Рекомбинантный ИЛ-18 человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), связывается с моно- и поликлональными анти-ИЛ-18 антителами, стимулирует продукцию ИФН?, ФНО в культурах МНК человека и реакцию гиперчувствительности замедленного типа у экспериментальных животных in vivo, что свидетельствует о специфической иммунохимической активности выделенного белка и его способности активировать клеточный иммунитет.

2. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок человека, полученный по оригинальной методике (продуцент E.coli), взаимодействует с поликлональными анти-ИЛ-18СБ антителами, в экспериментах in vitro отменяет стимулирующий эффект рИЛ-18 на продукцию ФНО мононуклеарными клетками человека и снижает ЛПС–индуцированную летальность экспериментальных животных in vivo, что подтверждает его специфические иммунохимические свойства и блокирующий эффект в отношении ИЛ-18.

3. Рекомбинантный ИЛ-18 связывающий белок снижает уровень продукции ФНО, стимулированный КонА, до спонтанного уровня, что свидетельствует о роли ИЛ-18 в регуляции провоспалительной активности мононуклеарных клеток.

4. Рекомбинантные белки ИЛ-18 и ИЛ-18СБ обладают противоопухолевой активностью в модели ортотопической солидной меланомы В16 и гематогенной метастатической меланомы В16, соответственно, что указывает на существование различных механизмов подавления опухолевого роста указанными белками.

5. Генотип СС, аллель С в позиции -137 промоторного участка гена ИЛ-18 и гапло-генотипы -607СС/-137СС и -607АА/-137GC у здоровых доноров сопряжены с низкой продукцией белка ИЛ-18, генотип СА, аллель А в позиции -607 и гапло-генотип -607CN/-137GN ассоциированы с относительно высоким уровнем продукции ИЛ-18, что свидетельствует о генетической детерминированности уровня продукции белка ИЛ-18.

6. Больные хроническим ВГВ характеризуются снижением частоты встречаемости генотипов –607AA и –607AA/-137CG и увеличением частоты встречаемости генотипа -607CC/-137CC по сравнению со здоровыми донорами, что указывает на роль генетического фактора в патогенезе вирусного гепатита В. 7. ИЛ-18 в культурах МНК больных хроническим вирусным гепатитом В восстанавливает исходно сниженный Тх1 ответ и усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток, о чем свидетельствует усиление пролиферативной активности МНК, продукции ИФН( и возрастание доли Т-клеток с внутриклеточным содержанием ИФН( и перфорина при сокультивировании с ДК, нагруженными антигеном вируса гепатита В.

8. Совместное культивирование ДК, нагруженных антигеном M. Tuberculosis (ЕSAT-6) и МНК больных туберкулезом легких в присутствии рИЛ-18 приводит к усилению антиген-специфических клеточных реакций, что подтверждается возрастанием продукции ИФН(, а также увеличением количества ИФН?-продуцирующих- и цитотоксических Т-лимфоцитов.

9. Пероральное применение трансгенной по гену ИЛ-18 моркови Daucus carota L. приводит к усилению продукции ИФН? спленоцитами, увеличению реакции гиперчувствительности замедленного типа и угнетению опухолевого роста в уретан-индуцированной модели аденокарциномы легких у мышей, что свидетельствует о наличии биологического эффекта ИЛ-18 в составе трансгенного растения.

10. Рекомбинантный белок ИЛ-18 обладает рядом специфических биологических эффектов и может быть эффективен для стимуляции клеточных иммунных реакций при онкологических состояниях, а также в клеточных технологиях при разработке дендритно-клеточных вакцин для модуляции иммунного ответа при инфекционных процессах.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 6-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН. 5-6 марта 2003 г. – с 256.

2. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Курамшин Д.Х., Лыков А.П., Ведина Л.В., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Биологическая активность рекомбинантного человеческого ИЛ-18 // Материалы 7-го Всероссийского научного Форума с международным участием им. Акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». 23-26 июня. Медицинская иммунология. – 2003. – Том 5, № 3-4. – С.429.

3. Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Эритропоэтин в лечении канцериндуцированных анемий // Евразийский медицинский журнал. – 2003. – № 1. – С.19-25.

4. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Балданов Н., Жеребцова Н.О., Филиппенко М.Л., Сенников С.В., Козлов В.А. Интерлейкин-18: противоопухолевая активность // Материалы объединенного иммунологического форума, Екатеринбург 2004. Russian Journal of Immunology. – 2004. – V.9. – № 1. – Р. 49.

5. Якушенко Е.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Проблемы использования рекомбинантного эритропоэтина для лечения канцериндуцированных анемий // В сб.: «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты». – Новосибирск, Наука, 2004. – С. 286-296.

6. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Характеристика интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе // В сб.: «Система цитокинов. Теоретические и клинические аспекты». – Новосибирск, Наука. 2004. – С. 125-140.

7. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов М.Л., Филипенко Е.А., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников С.В., Козлов В.А. Получение рекомбинантных цитокинов IL-18 и IL-18-связывающего протеина и исследование их биологической активности // Молекулярн. основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии Матер. VIII Всеросс. научн. Форума с междунар. участ. им. акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге». - Мед. иммунология. – 2004. – Т. 6, № 3-5. – С. 263-264.

8. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Pustoshilova N.M., Zakabunin A.L., Sennikov S.V., Kozlov V.A. Biological and specific activity of recombinant human Interleukin-18 // Cytokine network, and Regulatory Cells. – 2004. – P. 423-428.

9. Yakushenko E.V., Lopatnikova J.A., Khrapov E.A., Filipenko M.L., Sennikov S.V., Vlasov V.V., Kozlov V.A. Preclinical trials of Recombinant Human Interleukin-18 // Clinical and Investigative Medicine. – 2004. – № 4. – P. 70B.

10. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Сенников С.В. Интерлейкин-18 и его роль в иммунном ответе // Медицинская иммунология. – 2005 . – Т. 7, № 4. – С. 355-364.

11. Шевченко Ю.А., Якушенко Е.В., Романов В.В., Сенников С.В., Козлов В.А. Применение технологии ELTISpot для оценки специфического иммунного ответа на туберкулезный антиген ESAT-6 мононуклеарными клетками больных туберкулезом // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. – Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 103.

12. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Дейнеко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Сенников С.В., Шумный В.К., Козлов В.А. Изучение иммунорегуляторных эффектов перорального применения трансгенной моркови несущей ген ИЛ-18 // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитоки-ны. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. – Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 119.

13. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Пустошилова Н.М., Закабунин А.И., Сенников С.В., Козлов В.А. Исследование биологической активности рекомбинантных IL-18 и IL-18 связывающего белка // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. – Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 120.

14. Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Закабунин А.И., Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В. и др. Получение рекомбинантного интерлейкина-18 человека в клетках E.coli. // Матер. Всеросс. науч. симп. с междунар. участием: «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет», Новосибирск. 19-21 июля. – Цитокины и воспаление. – 2005. – Т. 4, № 2. – С. 125.

15. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18: биологические свойства и противоопухолевая активность рекомбинантного белка итрансгенного растения DAUCUS CAROTA L // Дни иммунологии в Сибири: Матер. Всеросс. научно-практ. конф., посвящен. 15-летнему юбилею Красноярского Краевого Центра по профилактике и борьбе со СПИД и другими инфекционными заболеваниями. (7-9 сентября 2005), Красноярск, 2005. – С. 134-136.

16. Сенников С.В., Филипенко М.Л., Якушенко Е.В., Храпов Е.А., Лопатникова Ю.А., Воронина Е.Н., Дейнеко Е.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Шумный В.К., Власов В.В., Козлов В.А. ИЛ-18 как стимулятор клеточного иммунитета // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции «Биотехнология и онкология». – Санкт-Петербург, 29-31 мая 2005. – С. 35.

17. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Задорожный А.В., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Филипенко М.Л., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Сенников С.В., Козлов В.А. Экспрессия ИЛ-18 связывающего белка человека в клетках E. COLI. И изучение биологической активности рекомбинантного белка // Сборник тезисов 1 Российско-американ-ской конференции «Биотехнология и онкология». – Санкт-Петербург 29-31 мая 2005. – С. 146-147.

18. Лопатникова Ю.А., Якушенко Е.В., Сенников С.В., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Дейнеко Е.В., Филипенко Е.А., Пухначева Н.А., Тюкавин Г.Б., Шмыкова Н.А., Шумный В.К., Козлов В.А. Трансгенная морковь, экспрессирующая ИЛ-18 и ее иммуномодулирующие свойства // «Иммунология Урала». – 2005. – №1(4). – С. 140-141.

19. Якушенко Е.В., Лопатникова Ю.А., Храпов Е.А., Воронина Е.Н., Филипенко М.Л., Закабунин А.И., Пустошилова Н.М., Сенников С.В., Власов В.В., Козлов В.А. Рекомбинантный человеческий интерлейкин-18: биологическая активность и противоопухолевые свойства // «Иммунология Урала». – 2005. – №1(4). – С. 162-163.


загрузка...