Влияние жидкостей с различным окислительно-восстановительным потенциалом на органы желудочно-кишечного тракта (10.09.2012)

Автор: Колесниченко Павел Дмитриевич

Жидкость с отрицательным ОВП в моделях патологий ЖКТ не обладает гастропротективными свойствами, ускоряет регенерацию язвенных дефектов слизистой оболочки желудка и проявляют гепатопротекторные свойства при хроническом тетрахлорметановом поражении печени.

Связь с планом НИР ГБОУ ВПО ВГМА им. Н.Н. Бурденко. Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Воронежская государственная медицинская академия имени Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации в соответствии с планом научно-исследовательских работ ВГМА, номер государственной регистрации 01.200.700012.

Личный вклад автора: Автору принадлежит ведущая роль в выборе дизайна исследования, определения целей задач работы и подбор методик, позволяющих достичь поставленных целей. Автором проведены все экспериментальные работы, кроме анализа крови, приготовления срезов и окрашивания микропрепаратов. Автором работы проведена статистическая обработка полученного материала.

Соответствие паспорту специальности. Содержание диссертации соответствует паспорту специальности фармакология, клиническая фармакология по пунктам 3, 4, 5, 8, 10, 12, 14.

Апробация диссертации. Апробация диссертации проведена на совместном заседании кафедр фармакологии, гистологии и нормальной физиологии ГБОУ ВГМА им. Н.Н. Бурденко (2012 г).

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на II и III Всероссийском научно - практическом семинаре молодых учёных «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» в ВолГМУ в 2010-2011г, Национальном конгрессе «Человек и лекарство» в 2010-2011г, на IV Всероссийской конференции молодых учёных «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (2011 г.), V, VI и VII Всероссийской Бурденковской студенческой научной конференции (г. Воронеж, 2009-2012 г); на XI и XII международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке, научные и прикладные аспекты концепции здоровья и здорового образа жизни» (РУДН, 2009-2011г.), XIX, XX, XVIII и Международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Украина, Ялта-Гурзуф, 2008, 2011 и 2012 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 193 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, трёх глав собственных результатов исследований, главы обсуждения результатов, заключения, выводов, научно-практических рекомендаций и списка использованной литературы, включающего 229 отечественных и зарубежных источников. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 36 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Исследование выполнено на 610 неинбредных белых крысах 2-7 мес. возраста обоего пола средней массой 180-250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария: в пластмассовых клетках на подстилке из опилок, при комнатной температуре (+18-22°С). Питание двухразовое натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам (ГОСТ Р 50258-92); свободный доступ к воде. Освещение в течение светового времени (12 часов) - совмещенное (естественное с люминесцентным) (Каркищенко Н.Н., 2003). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ (ГОСТ 3 51000.3-96 и 51000.4-96) и Приказу М3 РФ № 267 от 19.06.2003г. «Об утверждении правил лабораторной практики» (GLP), с соблюдением Международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых при экспериментальных исследованиях (ETS N 123,по состоянию на 30 декабря 2003 г.). При проведении экспериментов учитывались требования Комиссии по проблеме этики отношения к животным Российского национального Комитета по биоэтике наук и этические нормы, изложенные в «Международных рекомендациях по проведению медикобиологических исследований с использованием животных» (1989 г.). Настоящее исследование одобрено локальным этическим комитетом ВГМА им. Н.Н. Бурденко, протокол заключения № 5 от 15.04.2011г. Исследования проводились в течение двух лет.

На момент проведения экспериментов животные были адаптированы к человеческому фактору, прошли акклиматизацию и были здоровы. Изменений поведения, аппетита, режима сна и бодрствования, состояния шерстяного покрова, видимых слизистых - не обнаружено. Во всех сериях экспериментов кроме хронического гепатоза животные были разделены на 3 группы: 1-я контрольная группа (интактные здоровые животные) 2-я- (принимали вместо питьевой воды в свободном доступе жидкость с отрицательным ОВП -католит (К) с рН 8,2-9,0; ОВП минус 500-520мВ) и 3-я группа (принимали жидкость с положительным ОВП - анолит (А) рН 6,8-7,4, ОВП +690-770мВ).

В качестве жидкостей с измененным ОВП использовались электроактивированные водные растворы, приготовленные на сертифицированном оборудовании «Карат»: анолит (рН 6,8-7,4, ОВП (окислительно-восстановительный потенциал) + 690-770 мВ) и католит (рН 8,2-9,3, ОВП - 500-520 мВ).

Гистологические препараты тканей изготавливались на автоматических установках в патологоанатомическом отделении Железнодорожной больницы г. Воронеж. Изучение микропрепаратов проводилось на микроскопе «Leica DME» с цифровой фотокамерой «Leica EС3» и специальные компьютерные программы получения и обработки морфометрических данных LeicaLas EZ 2.0.0 (версия, поставляемая в комплекте с микроскопом), MMC Multimeter (MMCSoft) (пробная версия), и AxioVision от CarlCeiss (бесплатная версия) и «Mecos-1» (пробная версия программы). Тканевые базофилы изучались по микропрепаратам пищевода, желудка, тонкого и толстого кишечника, изъятым у каждой из 10 крыс соответствующей группы. На каждом препарате подсчёт проводился по 30 полям зрения.

Желудочный сок приготавливался согласно руководству к лабораторным работам по органической химии (Добрынина В.И., 1958) Величина ОВП измерялась с помощью ионометров рН 150 М, а величина рН- портативным рН-метром pH-410. Патологии моделировались препаратами бутадион, индометацин, ХЧ тетрахлорметан, препарат позитивного контроля - растительный гепатопротектор карсил (пр-во «Софарма»). В качестве конкрементов желчевыводящих путей использовались желчные камни, извлеченные интраоперационно в хирургическом стационаре ГКБ №2. Измерение силы прочности на разрушение проводилось согласно стандартным принципам измерения сопротивления материалов, принятых в технике. На этих принципах было сконструировано специальное устройство для измерения показателя силы прочности на разрушение, которое косвенно отражает изменение структуры желчных камней.

Исследования крови проводились в НИИ экспериментальной биологии и медицины ВГМА им. Н.Н Бурденко при участии автора.

При моделировании язвенной патологии использовались бутадионовая модель, предусматривающая однократное введение препарата бутадион внутрибрюшинно в дозе 250 мг/кг и индометациновая модель, которая предусматривала ежедневное введение внутрь через атравматический зонд индометацина (пр-во «Софарма») в дозе 5 мг/кг в течение пяти дней. Для моделирования гепатита использовалась стандартная методика, предусматривающая развитие хронического гепатита при введении внутрь 50% масляного четырёххлористого углерода в дозе 1 мл/кг дважды в неделю, на протяжении пяти недель (Хабриев Р.У., 2005).

Статистическая обработка

Описательная статистика применялась с помощью программы Excel 2010 из пакета программ MS Office 2010 (с макрос-дополнением XLSTAT-Pro - http://www.xlstat.com) на ПК Pentium V для генерации статистического отчета, содержащего информацию о центральной тенденции и изменчивости входных данных. В набор рассматриваемых этим способом параметров включались: проверка нормальности распределения, доверительные интервалы для нормального распределения, математическое ожидание, стандартная ошибка, минимальное значение ряда данных, максимальное значение ряда данных. Статистический анализ результатов исследований проводился с помощью программы Statistica 6.1, с использованием параметрических и непараметрических критериев (Хафизьянова Р.Х., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Дизайн исследования представлен на схеме

Иссследования in vitro.

Проведено измерение ОВП и рН желудочного сока при добавлении жидкостей с различным ОВП. Результаты представлены на рисунке 1 и 2.

Рис. 1. Влияние разведения желудочного сока водой, анолитом и католитом на рН желудочного сока. Достоверность указана при сравнении с водой.

Рис. 2. Влияние разведения желудочного сока водой, анолитом и католитом на ОВП желудочного сока. Достоверность указана при сравнении с водой.

Данные рисунка 1свидетельствуют о том, что при разведениях желудочного сока католитом рН меняется подобно воде, а при разведении анолитом происходит повышение рН, которое несколько отстаёт от повышения рН при разведении водой. Из рисунка 2 следует, что при разведении желудочного сока водой показатель ОВП практически не меняется, при разведении католитом с разведения 100/1 до 100/20 также практически не меняется, но при разведении 100/30 до 100/50 наблюдается резкое падение ОВП, после чего при всех последующих разведениях желудочного сока католитом следует плавное снижение показателя ОВП, затем величина ОВП постепенно возрастает.

Исследование конкрементов желчевыводящих путей проведено на 5 видах желчных камней, полученных интраоперационно от больных желчнокаменной болезнью людей. Высчитывалось на сколько % изменяется m (масса) и V (объём) по отношению к исходным значениям. Не учитывались данные по камням преимущественно бактериального состава, которые оказались наиболее подвержены влиянию жидких сред, и разрушаются в течение первой недели более чем на 50%. Анализ полученных данных показал, что только анолит увеличивает объём камней пигментно - бактериального состава до 34 % в сравнении с водой, которая увеличивает объём на 15%. Это увеличение объёма соотносится с достоверным снижением прочности 17 ньютонов на разрушение этого вида камней при действии анолита по сравнению с водой (41 ньютон). При действии остальных жидкостей объём, масса и прочность конкрементов на разрушение достоверно не отличаются.

В условиях in vitro исследовалась масса пристеночной слизи при действии жидкостей с различным ОВП. Результаты измерения слизистого барьера желудка при действии жидкостей с различным ОВП представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Масса слизи желудков (M±m, г.), изъятых у животных принимавших жидкости с различным ОВП и помещённых в физ. р-р и слизи желудков изъятых из интактных групп и помещённых в жидкости с различным ОВП.

Масса слизи Контроль Католит Анолит

граммы % граммы % граммы %

Жидкость per os 0,207±0,04 100% 0,17±0,034 82 0,159±0,034 77

Жидкость in vitro 0,08±0,021 100% 0,06± 0,024 75 0,166±0,049* 207

* p<0,05

Потенциал секреции желудков исследовался после двадцатидневного приёма жидкостей с различным окислительно - восстановительным потенциалом и последующей 18-часовой экспозиции в физ. растворе. Оказалось, что двадцатидневный приём жидкостей с различным ОВП не влияет на потенциал секреции слизистой оболочки желудка. Непосредственное влияние исследуемых жидкостей на стенку желудка определяли в желудках, изъятых из интактных животных после 18-часовой экспозиции в исследуемых жидкостях. При непосредственном действии на интактную слизистую оболочку желудка только анолит по сравнению с водой увеличивает массу пристеночной слизи желудка до 207%.

Таким образом, эксперименты in vitro показали, что католит изменяет рН желудочного сока подобно воде, анолит повышает рН желудочного сока в меньшей степени чем католит; а что касается ОВП, то католит его понижает, анолит оказывает двухфазное действие в зависимости от разведения. Непосредственное влияние изучаемых жидкостей на желчные камни проявляет только анолит в отношении пигментно - бактериальных камней, увеличивая объём камней и снижая их прочность на разрушение.

2. Исследования in vivo. Проведены эксперименты, направленные на исследование длительного влияния жидкостей с изменённым ОВП на общее состояние лабораторных крыс. Животные распределены на 3 группы: контрольная (40 крыс, принимали питьевую воду) и 2 опытные (по 40 крыс), принимавшие исследуемые жидкости вместо питьевой воды в свободном доступе.

?????????L

???????


загрузка...