Совершенствование микробиологической диагностики туберкулеза в учреждениях противотуберкулезной службы и общей лечебной сети (10.08.2009)

Автор: Севастьянова Элина Викторовна

Интенсивность роста штаммов M. tuberculosis (в КОЕ)

на различных вариантах среды Левенштейна-Йенсена

Вариант питательной среды Левенштейна-Йенсена Концентрация микобактериальной суспензии (количество мт/мл)

Штамм H37Rv Чувствительный клинический штамм Полирезистентный клинический штамм

10000 1000 100 10000 1000 100 10000 1000 100

Нативная (контроль) 82 29 15 80 36 19 38 14 6

Лиофилизированная 25 7 3 32 21 9 26 3 0

Нативная (из готовой солевой основы) >100 58 20 96 42 21 43 26 9

Результаты исследований показали, что интенсивность роста как чувствительных, так и лекарственно-устойчивых штаммов МБТ была значительно выше на нативных питательных средах Л-Й лабораторного производства, чем на лиофилизированной среде. Кроме того, при засеве лиофилизированной среды Л-Й микобактериальной суспензией полирезистентного клинического штамма, содержавшей 100 микробных тел/мл суспензии, роста получено не было. Это обстоятельство указывало на то, что выделение лекарственно-устойчивых МБТ на лиофилизированной питательной среде Л-Й у олигобациллярных больных не всегда возможно, в то время как данные больные являются контагиозными.

Изучение пригодности лиофилизированной среды Л-Й для постановки тестов на ЛЧ МБТ к основным ПТП показало существенные различия полученных результатов тестирования в зависимости от варианта использовавшейся питательной среды. У 19 из 40 исследованных лекарственно-устойчивых штаммов (т.е. в 47,5% случаев) на лиофилизированной среде Л-Й не выявлялся полный спектр лекарственной устойчивости. Кроме того, по сравнению с нативной, на лиофилизированной среде Л-Й визуально отмечалось значительное снижение массивности роста практически всех исследованных культур.

Снижение интенсивности роста культур и недовыявление спектра их резистентности на лиофилизированной среде объяснялось, вероятно, недостатком в ней питательных веществ, необходимых для оптимального роста МБТ. Однако некоторые лекарственно-устойчивые штаммы МБТ, имевшие, по-видимому, менее избирательные питательные потребности по сравнению с остальными культурами, показали одинаковый рост и спектр устойчивости на обеих испытуемых средах. Таким образом, результаты определения ЛЧ МБТ зависели как от индивидуальных культуральных особенностей конкретных штаммов, так и содержания питательных субстратов в используемой среде.

На основании выполненных исследований было установлено, что для проведения эффективной культуральной диагностики туберкулеза и достоверного определения ЛЧ МБТ необходимо применять только нативные питательные среды лабораторного производства, являющиеся полноценными по составу питательных веществ. Их использование обеспечивает выделение максимально возможного количества культур МБТ и позволяет определить истинный спектр лекарственной резистентности для всех тестируемых штаммов.

Далее были проведены сравнительные исследования спектра ЛУ МБТ и интенсивности роста культур при использовании трех различных вариантов нативной питательной среды Л-Й, один из которых был приготовлен по стандартной прописи из отечественных реактивов (контроль), а два остальных – из готовых сухих солевых основ: BBL Lowenstein-Jensen Medium Base, фирмы Becton Dickinson, и TB medium acc. to Lowenstein-Jensen (base), фирмы Merck. Тестирование лекарственной чувствительности 84 клинических штаммов МБТ, проведенное на трех испытуемых средах, показало полное совпадение спектра резистентности для всех исследованных культур при использовании как нативной среды Л-Й из отечественных реактивов, так и сред из готовых сухих солевых основ импортного производства. При этом на средах, приготовленных из сухих солевых основ, был отмечен более массивный рост МБТ по сравнению с контрольной нативной средой, как в пробирках с ПТП, так и в пробирках без них.

Проведенные исследования позволили рекомендовать использование питательной среды Л-Й на основе готового импортного солевого концентрата для проведения посевов и определения ЛЧ МБТ в ряде регионов России. Внедрение новой питательной среды было осуществлено в Ивановской, Томской, Владимирской и Нижегородской областях, а также в Республике Марий Эл.

Основным направлением совершенствования культуральной диагностики ТБ является сокращение сроков культивирования МБ, что чрезвычайно важно как для лечения больного, так и контроля за распространением туберкулезной инфекции. В связи с этим, проведены сравнительные исследования эффективности традиционных и ускоренных методов выявления возбудителя и тестирования ЛЧ.

Исследование воспроизводимости результатов определения ЛЧ МБТ традиционными методами пропорций и абсолютных концентраций, выполненное на 40 клинических изолятах M. tuberculosis, показало равную диагностическую значимость обоих методов и позволило рекомендовать к использованию в практических лабораториях страны метод абсолютных концентраций, как более простой, доступный и экономичный.

Однако традиционные методы определения ЛЧ требуют значительных затрат времени. В то же время, организация ускоренной диагностики ЛЧ МБТ с использованием дорогостоящих автоматизированных систем бульонного культивирования нередко вызывает трудности из-за недостаточного финансирования лабораторий, в результате чего возникает необходимость использования более дешевых, но не уступающих по скорости методик.

В ЦНИИТ РАМН был разработан ускоренный нитратредуктазный метод определения ЛЧ МБТ на плотных питательных средах, принцип которого заключается в выявлении жизнеспособных МБ путем регистрации их ферментативной активности при отсутствии видимого роста культуры. Метод основан на способности МБТ восстанавливать нитраты в нитриты, присутствие которых выявляется специфическими реагентами, дающими цветную реакцию.

Тестирование ЛЧ МБТ с помощью ускоренного нитратредуктазного метода позволяет сократить длительность анализа с 21-28 суток до 8-12 суток при использовании среды Л-Й или до 4-7 суток при использовании среды Попеску, что сопоставимо со сроками определения ЛЧ с помощью автоматизированных систем бульонного культивирования, но в то же время значительно дешевле.

Наши исследования показали, что ускоренный нитратредуктазный метод определения ЛЧ МБТ является достаточно точным и не уступает по чувствительности традиционному методу абсолютных концентраций, обеспечивая полноценное определение спектра лекарственной устойчивости. Проведенное нами на 1520 клинических штаммах МБТ параллельное определение ЛЧ ускоренным нитратредуктазным методом и методом абсолютных концентраций на среде Л-Й показало совпадение результатов тестирования в 96,6% случаев.

Полученные результаты позволили сделать заключение о том, что апробированный метод обеспечивает быструю и точную детекцию лекарственно-устойчивых штаммов МБТ и может рассматриваться в качестве недорогой альтернативы автоматизированным технологиям, особенно при скудных ресурсах. Ускоренный нитратредуктазный метод является модификацией традиционного метода абсолютных концентраций и наряду с ним может быть рекомендован к применению во всех БЛ противотуберкулезных учреждений (ПТУ) России.

Составленное нами подробное описание способа и техники выполнения ускоренного тестирования ЛЧ МБТ нитратредуктазным методом с помощью реактива Грисса представлено в МЗиСР РФ для внесения предлагаемой методики в Приказ № 109 в качестве альтернативного метода определения ЛЧ МБТ.

Существенное сокращение длительности определения ЛЧ МБТ может быть достигнуто как в результате использования для анализа жидких питательных сред, так и за счет исследования ЛЧ прямым методом, в связи с чем, нами была изучена возможность применения в системах бульонного культивирования прямого метода тестирования ЛЧ МБТ. Сравнительная оценка эффективности использования различных ускоренных, в том числе – прямых методов тестирования ЛЧ МБТ, выявила, что спектр ЛУ, определенный различными методами, практически совпадал, в то время как сроки получения результатов с помощью прямых методов исследования были значительно сокращены.

Прямой метод определения ЛЧ МБТ с использованием системы BACTEC-460 позволял получить результаты исследования в период с 5 по 18 сутки от момента посева диагностического материала. Длительность анализа зависела от массивности бактериовыделения, определенной методом микроскопии, и составляла в среднем 9,3±2,1 суток.

По сравнению с BACTEC-460, использование системы MGIT позволяло получить результаты прямого тестирования ЛЧ МБТ на несколько суток позднее – в период с 7 по 25 сутки от момента посева, что в среднем составляло 16,3±4,1.

Скорость получения результатов при прямом тестировании ЛЧ МБТ на плотной среде Попеску составляла от 15 до 25 суток (среднее значение 19,4±2,1).

Результаты ЛЧ МБТ, определенные с помощью непрямого ускоренного нитратредуктазного метода, были получены в период с 32 по 64 сутки от момента посева диагностического материала (в среднем на 45,7±5,2 сутки).

Проведенные исследования позволили сделать вывод о том, что системы бульонного культивирования BACTEC-460TB и MGIT manual могут быть использованы для прямого определения ЛЧ МБТ, так как позволяют получать адекватные результаты тестирования, причем в более короткие сроки по сравнению с прямым определением ЛЧ МБТ на плотных средах и, тем более, – по сравнению с непрямым ускоренным нитратредуктазным методом.

С целью оценки результатов применения ускоренных методов в клинической практике, у 83 больных с лекарственно-резистентными остропрогрессирующими формами туберкулеза легких был проведен анализ эффективности химиотерапии (х/т) в зависимости от сроков её коррекции, проведенной по данным ЛУ МБТ, полученным с помощью различных методов тестирования.

Установлено, что показатель прекращения бактериовыделения по окончании 4-го месяца лечения у больных с лекарственно-резистентными штаммами при ранней коррекции х/т по данным прямого определения ЛУ МБТ на BACTEC-460, полученным на 8-10 сутки от момента посева диагностического материала, был практически таким же, что и у больных с лекарственно-чувствительными штаммами МБТ, – соответственно 80% и 84% (р>0,05).

При коррекции х/т с использованием непрямого ускоренного нитратредуктазного метода прекращение бактериовыделения наблюдалось в 62,9% случаев. Это обстоятельство объяснялось тем, что в этом случае коррекция х/т проводилась в более поздние сроки – через 1,5-2 месяца от начала лечения.

Результаты тестирования ЛЧ МБТ, полученные прямым методом исследования в системе BACTEC-460 и непрямым ускоренным нитратредуктазным методом, полностью совпадали. Таким образом, использование прямого метода определения ЛЧ МБТ на BACTEC-460 позволяло за 8-10 дней достоверно выявить наличие ЛУ и своевременно провести соответствующую коррекцию х/т на ранних этапах лечения, значительно повышая тем самым его эффективность.

Проведенные испытания показали, что применение автоматизированных систем и жидких питательных сред дает высокую воспроизводимость результатов и позволяет стандартизовать исследования, а в сочетании с использованием прямого метода тестирования ЛЧ МБТ – значительно сокращает время исследования. Однако следует учитывать существенные трудозатраты персонала при выполнении процедур микробиологического исследования диагностического материала с использованием систем бульонного культивирования, а также высокую стоимость расходных материалов. В связи с этим указанным оборудованием рекомендуется оснащать только крупные централизованные БЛ, выполняющие большое количество исследований и имеющие достаточные материальные ресурсы. В остальных случаях рекомендуется использовать для тестирования ЛЧ МБТ непрямой ускоренный нитратредуктазный метод, а для больных с остропрогресссирующим течением туберкулезной инфекции – дополнительно прямой метод с использованием плотной питательной среды Попеску.

Изучение биологических свойств клинических штаммов МБТ с МЛУ к ПТП

Одной из причин ухудшения эпидемиологической ситуации по ТБ являлось распространение лекарственно-устойчивых форм заболевания. В настоящее время туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью к ПТП представляет собой очень серьезную проблему, вследствие чего изучение биологических свойств штаммов M. tuberculosis с МЛУ имеет важное научно-практическое значение.

Нами проведена сравнительная количественная оценка вирулентности лекарственно-устойчивых и чувствительных клинических и лабораторных штаммов МБ, а также изучена степень устойчивости штаммов с МЛУ и оценены их ростовые свойства в сравнении с контрольными чувствительными культурами.

Было установлено, что исследованные лабораторные и клинические штаммы характеризовались различным уровнем накопления МБ в организме животных. Для отдельных лекарственно-устойчивых клинических штаммов был отмечен более низкий уровень накопления МБ в органах морских свинок по сравнению с контрольными чувствительными культурами, в качестве которых использовали чувствительный клинический штамм МБТ и высоковирулентный лабораторный штамм M. tuberculosis Erdman. Однако большинство резистентных культур МБТ (в том числе – штаммы с МЛУ) по уровню обсемененности паренхиматозных органов зараженных ими морских свинок, определенному по числу КОЕ МБ в 1г органа, практически не отличались от вирулентных чувствительных культур и обладали выраженной пневмотропностью, что могло указывать на их эпидемическую опасность (табл. 4).

Таблица 4

Обсемененность паренхиматозных органов морских свинок,

зараженных различными штаммами микобактерий


загрузка...