Влияние электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода и оксида азота на прокариотические клетки (10.05.2011)

Автор: Пронина Елена Александровна

Основные положения работы доложены и обсуждены на XIII, XIV, XV pоссийских cимпозиyмах с мeждyнaрoдным yчаcтиeм «Mиллимeтрoвыe вoлны в медицинe и биoлoгии» (Москва, 2003, 2007, 2009), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Санкт-Петербург, 2009), IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009), III Всемирном конгрессе по клинической патологии и реабилитации в медицине (Паттайя, Таиланд, 2005), симпозиуме «Магнитные поля и здоровье человека» (Курск, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Социальные проблемы медицины и экологии человека» (Саратов, 2009), V Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, в том числе 12 в реферируемых журналах, включенных в перечень периодических научных и научно-практических изданий, рекомендованных ВАК РФ. Получен патент РФ № 2007129978/13 от 19.08.2008 на изобретение «Устройство для облучения клеток биокультуры».

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, объектов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, библиографического списка, включающего 317 отечественных и 217 зарубежных источников. Текст диссертации изложен на 265 страницах, содержит 13 таблиц и 47 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту:

Воздействие ЭМИ на частоте МСПИ O2 приводит к изменению динамики развития бактериальных популяций.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO снижает уровень устойчивости грамположительных и грамотрицательных бактерий к антибиотикам с различным механизмом действия.

Облучение ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 угнетает экспрессию генов лекарственной устойчивости.

Воздействие ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2 изменяет уровень активности ферментов антиоксидантной защиты бактерий.

Применение ЭМИ на частоте МСПИ O2 при лечении экспериментальной гнойной инфекции существенно не влияет на течение раневого процесса. Применение ЭМИ на частоте МСПИ NO при лечении экспериментальной гнойной инфекции положительно сказывается на течение раневой инфекции – стимулирует заживление и сокращает сроки эпитализации гнойных ран.

Сочетанное применение ЭМИ на частоте МСПИ NO с антибиотиками при лечении экспериментальной гнойной инфекции более эффективно, чем лечение каждым из них в отдельности.

Облучение ЭМИ на частоте МСПИ O2 повышает способность бактерий к формированию биопленки, a облучение ЭМИ на частоте МСПИ NO тормозит этот процесс.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы стандартные штаммы E. coli АТСС 25922, S. aureus АТСС 6538-Р, P. aeruginosa АТСС 27853, полученные из Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича; E. coli j 53 (RP-1) (плазмидная устойчивость к канамицину (Km), тетрациклину (Tc)) и E. coli j 53 (R 100.1) (плазмидная устойчивость к левомицетину (Cm) и стрептомицину (Sm)), полученные из музея живых культур Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб»; 40 клинических штаммов E. coli, S. aureus и 50 штаммов P. aeruginosa, выделенных от больных, находившихся на лечении во 2-й клинической больнице г. Саратова.

Питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (Махачкала, Россия), мясо-пептонный агар (Махачкала, Россия), бульон Мюллера-Хинтона («bioMerieux», Франция), агар Мюллера-Хинтона («bioMerieux», Франция), трипказо-соевый агар («bioMerieux», Франция), среда LB («Sigma», США).

Антибиотики: цефтазидим («Синтез», Россия), цефотаксим («Lek DD», Словения), стрептомицин сульфат («Агрофарм» Россия), канамицин («ICN», США), гентамицин («Lederle», США), амикацин («Биосинтез», Россия), левомицетин натрия сукцинат («Синтез» Россия), линкомицин («Lek DD», Словения).

», США), трихлоруксусная кислота, соляная кислота, гептан («ТехноСоюз», Россия), изопропиловый спирт («ТехноСоюз», Россия), серная кислота («ТехноСоюз», Россия).

Экспериментальные животные: белые беспородные мыши, самцы, массой 18-20 г.

Эксперименты по изучению воздействия электромагнитного излучения на частотах молекулярных спектров излучения и поглощения оксида азота и атмосферного кислорода проводились на впервые разработанных в ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов) генераторах, в которых возбуждались электромагнитные КВЧ-колебания, имитирующие структуру молекулярного спектра поглощения и излучения атмосферного кислорода на частотах 129±2 ГГц и оксида азота 150±2 ГГц (Креницкий А.П., Майбородин А.В., Бецкий О.В.

и соавт., 2003).

Точное значение заданной частоты определяли в соответствии с международной базой данных молекулярных спектров высокого разрешения HITRAN, созданной с участием космического агентства и с учетом поправок на атмосферное давление и температуру окружающей среды (Бецкий О.В.

и соавт., 2007).

В работе использовались два типа генераторов: стационарный и малогабаритный.

Стационарный генератор: квазиоптический КВЧ-генератор детерминированных шумов, разработанный в ОАО «ЦНИИИА» (г. Саратов) (Креницкий А.П., Майбородин А.В., Бецкий О.В. и соавт., 2003).

Одним из важных условий культивирования прокариотических клеток является температура окружающей среды. В связи с этим при проведении исследований по воздействию электромагнитного излучения на прокариотические клетки необходимо было обеспечить условия термостабилизации в процессе облучения. Для этого была разработана установка, состоящая из суховоздушного термостата ТС-80М-22 и помещенного в него квазиоптического генератора. С помощью квазиоптического программируемого генератора обеспечивалось облучение объектов исследования на частотах молекулярных спектров поглощения и излучения атмосферного кислорода (129 ГГц) и оксида азота (150 ГГц) непосредственно в процессе термостатирования.

Малогабаритный генератор: генератор, работающий на частотах 129 ГГц и 150 ГГц, разработан в медико-технической ассоциации КВЧ (г. Москва) совместно с ФГУП «НПП-Исток» (г. Фрязино) и ОАО «ЦНИИИА»

(г. Саратов).

Малогабаритный генератор использовался для облучения животных, при экспериментальной раневой инфекции; во всех остальных экспериментах использовался стационарный генератор.

Минимальную подавляющую концентрацию (МПК) антибиотиков определяли в жидкой питательной среде Мюллера-Хинтона методом серийных разведений (МУК 4.2.1890-04.).

Результаты влияния ЭМИ на уровень устойчивости к антибиотикам оценивали по коэффициенту ингибирования устойчивости (КИУ), равному отношению МПК антибиотиков до и после облучения бактериальных культур.

Антибиотикочувствительные мутанты выявлялись методом реплик (Lederberg J., Lederberg E.M., 1952) после воздействия на культуры кишечной палочки ЭМИ на частотах МСПИ NO и МСПИ O2.

Активность каталазы определяли колориметрическим методом (Королюк М.А., 1988).

Активность супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по методике

С. Чевари и соавт. (1981).

Для оценки активности пероксидазы использовали метод А.Н. Бояркина (Ермаков А.И., 1987).

Определение диеновых конъюгатов (ДК) проводили по методу И.Д. Стальной (1977), малонового диальдегида (МДА) – по методу И.Д. Стальной и Г.Г. Гаришвили (1977).

Гемолитическую активность бактерий оценивали по диаметру зоны гемолиза вокруг колоний исследуемых штаммов на кровяном агаре, содержащем 5% отмытых физиологическим раствором эритроцитов (Выгодчиков Г.В., 1963). Штаммы, для которых эта величина составила менее 3 мм, оценивались как обладающие низкой гемолитической активностью; зона гемолиза, равная 3-6 мм, свидетельствовала о средней степени гемолитической активности, более 6 мм – о высокой.

Протеолитическую активность штаммов определяли на среде, содержащей 2% LA и 30% молока (Citti I., 1963). О количественном значении данного признака судили по размерам диаметра зоны просветления. При диаметре зоны просветления до 3 мм штамм расценивался как обладающий низкой протеолитической активностью, 3-4 мм – средней, более 4 мм – высокой.

Вирулентность штаммов определяли при внутрибрюшинном заражении белых мышей взвесью суточной культуры бактерий. Вычисление LD50 проводили по методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина (1962).

Раневую инфекцию воспроизводили на белых беспородных мышах, самцах, массой 18-20 г в соответствии с требованиями Федерального закона от 01.01.1997 г. «О защите животных от жестокого обращения» и предписаниями Женевской конвенции «International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals» (Geneva, 1990). Животным под легким эфирным наркозом на предварительно выбритых участках кожи в области спины наносили кожные раны длиной и шириной 10,0 мм, глубиной 2,0 мм. Раневая инфекция воспроизводилась путем инфицирования поверхности раны взвесью суточной агаровой культуры в количества 0,1 мл микробной взвеси (109 мк.т./мл). Раневая инфекция развивалась к третьим суткам.

Оценку результатов проводили по двум показателям: планиметрическое исследование раневой поверхности и сроки заживления ран (Попова Л.Н., 1942; Фенчин К.И., 1979). Лечение антибиотиками и электромагнитным излучением осуществляли ежедневно, начиная с третьих суток от момента инфицирования раны, в течение десяти дней. Срок наблюдения за животными составлял 30 дней.


загрузка...