ЦИТОКИНЫ В СОВРЕМЕННОМ КОМБИНИРОВАННОМ ЛЕЧЕНИИ НЕКОТОРЫХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ (09.02.2009)

Автор: Гуторов Сергей Львович

4. Результаты иммунологических исследований.

4.1. Влияние Альнорина на показатели иммунного статуса больных диссеминированной меланомой кожи.

Исследование проведено у 61 больного, получившего лечение Альнорином при самостоятельном применении и в сочетании с химиотерапией.

Альнорин при самостоятельном применении не продемонстрировал заметного иммуномодулирующего действия при оценке средних показателей пропорции отдельных субпопуляций лимфоцитов и при определении частоты отклонений у больных количеств тех или иных клеток от нормального уровня.

Состояние иммунного статуса было исследовано у 46 больных, получавших химиотерапию в сочетании с Альнорином. В целом по группе состояние иммунного статуса больных не отличается существенно от контрольной группы (здоровые доноры). Статистически значимые различия выявлялись только в пропорции CD3+ и CD38+ клеток. При этом пропорция CD3+ клеток, хотя была и ниже, чем в контрольной группе, однако она укладывалась в общепринятую норму (60-75%). Количество CD38+ клеток, напротив, было повышено у этих больных по сравнению с лицами контрольной группы, однако оно также была в границах общепринятой нормы (24-40%). Сравнение показателей иммунного статуса до- и по окончании лечения по всей группе больных, получавших химиотерапию в сочетании с Альнорином показало только возрастание пропорци HLA-DR клеток, которое хотя и оказалось статистически значимым (р<0,05), тем не менее было как до, так и по окончании лечения в пределах нормы (7-15%).

Изменения в иммунограмме после лечения были отмечены только в отношении клеток, экспрессирующих антигены HLA-DR и CD25 (рецептор для интерлейкина-2). При этом в группе больных, имеющих лечебный эффект нарастание пропорции CD25+ клеток было существенным – с 2,96 до лечения до 12,9 после лечения (норма <5%).

Исключением было заметное снижение процента больных с превышающей норму пропорцией CD16+ и увеличением процента больных с нормальным количеством этих клеток у получавших химиотерапию с последующим введением Альнорина. При этом существенно увеличилось количество больных с повышенной цитотоксической активностью NK-клеток, что может говорить о возрастании их цитотоксического потенциала.

4.2. Влияние химиотерапии с включением Ингарона на показатели иммунного статуса больных диссеминированной меланомой кожи.

Сравнительный анализ групп больных, не имевших и имевших эффект лечения показал, что по некоторым параметрам они различались между собой. У больных, леченных с эффектом, процент CD8+ Т-лимфоцитов, исходно был ниже, чем у здоровых лиц, чего не было у больных, получивших неэффективное лечение, а В-клеток (CD20+) – выше. Лечение Ингароном и химиотерапией привело к определенным изменениям в каждой из групп больных, и эти изменения различались в зависимости от исхода терапии.

Больные, достигшие лечебного эффекта, получили от 2 до 10 курсов лечения. Исходно сниженная у них пропорция CD3+, CD5+ и CD7+ -клеток оставалась сниженной на протяжении 4 курсов лечения и снижалась в еще большей степени после 6-го курса, когда прогрессирование болезни было у 53,6% больных. Процент лимфоцитов с маркером CD38, исходно повышенный, увеличивался после 2-го курса, а затем снижался после 6 курса (т.е. перед прогрессированием).

Также к моменту прогрессирования повышалась пропорция лимфоцитов, экспрессирующих рецептор для интерлейкина-2 (CD25+-клетки). Количество этих клеток немного нарастало на протяжении эффективного лечения, но перед прогрессированием резко повышалось. Это же имело место и в группе больных, получивших лечение без эффекта. Возможно, нарастание CD25+ лимфоцитов было связано с прогрессированием болезни.

Особенный интерес представляет соотношение динамики количеств NK-клеток (CD16+) и их цитотоксической активности. На фоне неэффективной терапии она увеличивалась с одновременным возрастанием их цитотоксичности. В то же время у больных, получавших лечение с эффектом, количество CD16+-клеток снижалось, параллельно с повышением их цитотоксичности, что говорит о повышении их цитотоксического противоопухолевого потенциала.

Таким образом, реализация эффекта лечения Ингароном и химиотерапией совпадала с увеличением цитотоксического потенциала NK-клеток. Прогрессирование же заболевания было на фоне возрастания количества этих клеток, но без их активации, а видимое возрастание цитотоксичности NK-клеток является результатом увеличения их количества в общей популяции лимфоцитов.

4.3. Результаты иммунологических исследований при метастазах рака почки.

Проведен анализ изменений в иммунологическом статусе, позволяющих прогнозировать вероятность достижения лечебного эффекта ?-ИФН.

Были определены различия показателей клеточного компонента иммунологического статуса больных в зависимости от достижения эффекта лечения ?-ИФН. Больные были разделены на две группы: в 1 включены эффективные случаи (полный + частичный + стабилизация болезни), во 2 – неэффективные. Сравнение основных исходных параметров иммунного статуса обеих групп с показателями контроля (здоровые доноры) показало, что при метастазах рака почки имелось статистически значимое (р? 0,003) снижение общего количества Т-лимфоцитов (CD3+, СD5+, CD7+ клеток), лимфоцитов, экспрессирующих молекулу адгезии CD50, а также снижение цитотоксической активности NK-клеток. Кроме того, у больных, имевших эффект лечения, исходно было статистически значимое снижение пропорции лимфоцитов, экспрессирующих молекулу апоптоза CD95.

Все отклонения от нормального уровня пропорций отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов значительно сильнее проявлялись при отсутствии эффекта лечения.

Исходная активность NK-клеток была снижена у всех больных в сравнении с контрольной группой. Однако во 2 группе оно было сильнее, и более значимым, чем в первой. В то же время пропорция этих клеток с маркером CD16 была нормальной в обеих группах, что, свидетельствует об истинном снижении их функциональной активности.

Выше были приведены данные о нарушениях средних показателей пропорции отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов у всех обследованных больных, в зависимости от наличия или отсутствия лечебного эффекта. Анализ частоты таких нарушений в группах показал, что по ряду показателей она различалась.

У больных 1 группы, исходно нормальная пропорция Т-лимфоцитов, определяемая по пан-Т-клеточным маркерам CD3 и CD5, встречалась чаще, чем при прогрессировании болезни – 54,7% и 73,7%, соответственно, в 1 группе и 34,7% и 29,4% во 2, и эти различия были статистически значимы (р=0,04 для CD3 и р=0,005 для CD5).

Напротив, в 1 группе больные со сниженным количеством CD3+, CD5+ и CD7+ клеток встречались реже, чем во 2, причем для CD5+ клеток эта разница была статистически значима (р=0,02). Хотя эти группы не различались достоверно по средним показателям пропорции CD4+ клеток, тем не менее сниженная их пропорция была достоверно реже у больных 1 группы, чем во второй: 18,9% и 44,9% соответственно (р=0,04). В 1 группе недостоверно чаще были больные с повышенным соотношением иммунорегуляторного индекса CD4+/CD8+, т.е. с превалированием субпопуляции CD4+ клеток над лимфоцитами с фенотипом CD8+. Были заметны также различия и в отношении Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры, характерные для активированных клеток (HLA-DR, CD38, CD11b) – сниженная их пропорция чаще была у больных, не имевших эффекта лечения.

Снижение активности NK-клеток, достоверно чаще встречалось и было более выраженным у больных 2 группы, чем у эффективно леченных больных 70,6% и 32,1% соответственно (р=0,03). У неэффективно леченных больных чаще была повышена цитотоксичность этих клеток (р=0,03). В свою очередь, у больных 1 группы нормальная активность NK-клеток определялась в 64,3%, в то время как во второй достоверно реже – у 23,5% больных (р=0,0002).

В заключение можно отметить, что эффект лечения ?-ИФН в большей степени может быть ожидаем у больных с наименее выраженными исходными нарушениями клеточного иммунитета.

Анализ иммунограмм всех больных раком почки до лечения выявил нарушения концентрации сывороточных иммуноглобулинов классов G, A и M. При этом концентрации IgG и IgA были повышены – 14,42±1,64 и 3,31±0,45 г/л при норме 12,08±0,86 и 2,26±0,2 соответственно; при этом для IgA различия были достоверны (p=0,03). Средняя же концентрация IgM оказалась достоверно сниженной – 0,9±0,09 против 1,43±0,13 в контрольной группе (р=0,01).

Однако при разделении больных на группы в зависимости от эффекта лечения оказалось, что все эти изменения были только у больных 1 группы. Во второй, концентрации иммуноглобулинов всех трех классов были ниже, чем в контроле, хотя эти различия не были статистически значимыми. Анализ частоты этих нарушений показал, что в группе эффективно леченных больных подавляющее их число имело нормальную концентрацию IgG (78,6%) и повышенную IgA (88,9%), тогда как во второй группе у всех (100%) больных были низкие концентрации IgG и IgM, а у половины больных оказалась повышенной концентрация IgA.

Анализ частоты изменений параметров иммунного статуса на фоне лечения показал, что у эффективных случаях статистически значимые изменения произошли в отношении количества активированных лимфоцитов (CD38+) и лимфоцитов, экспрессирующих молекулу CD50. Сниженное и нормальное количество CD38+ клеток отмечалось у 61,5% и 38,5%, а после лечения – у 13,3 и 60% соответственно (р<0,05), помимо этого, у 26,7% больных в этой группе оно стало даже повышенным.

Сниженное количество CD50 клеток было выявлено более чем у половины больных в обеих группах. После лечения, при наличии эффекта, оно нормализовалось и оставалось сниженным лишь у 5,3%. При отсутствии эффекта число лиц со сниженной пропорцией этих клеток хотя и уменьшалось, но в меньшей степени, чем в первой группе, составив 28,6%.

Иная картина наблюдалась у больных с прогрессированием заболевания. В этой группе сохранялось неизменным количество больных со сниженной пропорцией Т-лимфоцитов (CD3+клеток), лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры и CD11b. Уменьшался, но в гораздо меньшей степени, чем в эффективных случаях, процент больных со сниженной пропорцией CD50+ клеток и не менялось число больных с низкой активностью NK-клеток.

В различной степени у больных с разными результатами лечения менялись и концентрации иммуноглобулинов в сыворотке крови. У больных, получавших лечение с клиническим эффектом концентрации иммуноглобулинов не изменились. У больных с прогрессированием заболевания повышалось исходно сниженное содержание IgG, IgA и IgM в сыворотке крови, хотя это возрастание не было статистически значимым.

4.4. Усиление Альнорином цитотоксического действия противоопухолевых лекарств: роль экспрессии гена bcl-2.

Опыты проводились на культуре клеток HeLa – дикого типа и этих же клетках, в которые с помощью ретровирусной конструкции был введен дополнительный ген bcl-2. Альнорин в концентрациях 100 и 1000МЕ/мл, которые сами по себе не токсичны для клеток, повышал цитотоксический эффект Доксорубицина, причем на клетках HeLa-bcl2 в большей степени, чем на клетках дикого типа – и 12,3 и 7,9 раза соответственно.

Большинство противоопухолевых лекарств вызывают гибель опухолевых клеток путем индукции в них апоптоза. Альнорин также усиливал чувствительность клеток к апоптозиндуцирующему действию Доксорубицина. И он также более эффективен в отношении клеток, гиперэкспрессирующих bcl-2, чем для интактных клеток HeLa.

Альнорин в дозе, в которой он сам не индуцирует апоптоз, повышает его индукцию Доксорубицином в 133,8 раза на клетках HeLa-bcl2, в то время как на клетках дикого типа только в 20 раз. Иными словами, Альнорин усиливает цитотоксичность и апоптоз-индуцирующие свойства Доксорубицина, взаимодействуя с активностью антиапоптотического гена bcl-2.

При этом он более значительно влиял на индукцию апоптоза, чем на цитотоксическое действие. Концентрация Доксорубицина, необходимая для 50%-ного цитотоксического эффекта составляла 5,35 мкг/мл на клетках HeLa дикого типа и 10,7 мкг/мл для клеток HeLa с гиперэкспрессией гена bcl-2, а для индукции 50% апоптоза – 580,25 и 1432 мкг/мл соответственно.

Мы также исследовали влияние Альнорина на цитотоксичность препаратов, применяемых при лечении меланомы – Нидрана (ACNU) и Дакарбазина (DTIC) – на клетках 4 меланом человека in vitro. Три из этих меланом оказались примерно в равной мере чувствительными к цитотоксическому действию Нидрана: его концентрации, необходимые для 50%-го цитотоксического эффекта в отношении клеток линий меланомы Mel-P, Mel-Korr и Mel-Is составили 256,35, 191,0 и 212,96 мкг/мл соответственно.

В то же время клетки меланомы Mel-Rac оказались высокорезистентнвми, их ЦД50 оказалась равной 727,0 мкг/мл, т.е. в 6,7 раза выше, чем для наименее чувствительной линии Mel-P. Добавление в культуральную среду вместе с Нидраном Альнорина в концентрациях, в которых он сам не влияет на интенсивность роста клеток (1000 МЕ/мл и 100 мкг/мл), практически не повиляло на цитотоксический эффект Нидрана в отношении чувствительных клеток меланом линий Mel-P, Mel-Korr и Mel-Is. Однако в присутствии

1000 МЕ/мл Альнорина резко возрос цитотоксический эффект Нидрана в отношении клеток резистентной линии Mel-Rac. 50% цитотоксическая доза (ЦД50) Нидрана для клеток этой линии снизилась с 727 мкг/мл до 164,4 мкг/мл. Даже 100 МЕ/мл Альнорина оказались эффективными – ЦД50 Нидрана снизилась до 189,7 мкг/мл, т.е. в 4,3 и в 4,1 раз соответственно.

Таким образом, под влиянием Альнорина в этих экспериментах ЦД50 Нидрана в отношении клеток резистентной линии Mel-Rac снизилась ниже уровня наиболее чувствительной линии Mel-Korr.

Чувствительность клеток линий меланом оказалась различной и к цитотоксическому действию Дакарбазина. Наиболее резистентными оказались клетки линий Mel-P и Mel-Rac. Альнорин повышал, хотя и в меньшей степени чувствительность этих относительно резистентных клеток к цитотоксическому действию Дакарбазина в 1,2 и 2,88 раз соответственно.

Полученные данные позволяют заключить, что фактор некроза опухолей альфа (Альнорин) оказывает терапевтический эффект при меланоме не столько путем иммуномодулирующего действия, но повышением чувствительности опухолевых клеток к цитотоксическому и апоптоз-ндуцирующему действию лекарств.


загрузка...