Оптимизация диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза при иммуновоспалительных заболеваниях (ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите) (09.02.2009)

Автор: Барышева Ольга Юрьевна

В ходе исследования у больных РА оценивались параметры суставного синдрома, стадия патологического процесса, степень общей активности, у больных СКВ – вариант течения заболевания, степень активности, наличие поражения почек, почечной недостаточности, у больных ХГН – клинический и морфологический вариант заболевания, степень активности, наличие почечной недостаточности.

Клинические методы исследования

Оценка общего суставного синдрома у больных РА клинически проводилась по следующим параметрам: суставной индекс Ричи (СИР), общий счет болезненных суставов (СБС), общий счет припухших суставов (СПС), утренняя скованность (УС), оценка выраженности боли пациентом с использованием визуальной аналоговой шкалы (ВАШ) в покое и при физической нагрузке, для оценки общей активности заболевания использовался комбинированный индекс Disease Activity Score (DAS4). Для оценки эффективности терапии использовалось динамика индекса DAS 4 cогласно рекомендациям EULAR.

При СКВ и ХГН больные исследованы клинически по стандартам осмотра больных терапевтического профиля без использования специальных методов исследования.

У больных СКВ для оценки активности заболевания рассчитывался индекс SLEDAI (Systemic lupus erythematosus disease activity index) по сумме баллов в зависимости от наличия поражения органов и систем. Возможная максимальная сумма баллов 105. При уменьшении индекса SLEDAI на 6 баллов констатировалось улучшение, при увеличении на 8 баллов – ухудшение течения заболевания.

Лабораторные методы исследования

Всем больным выполнялось исследование клинического анализа крови, общего анализа мочи, определение уровня общего белка с помощью прецизионного рефрактометра, белковых фракций с использованием диагностического набора для электрофоретического разделения белков сыворотки крови на агарозе “Cormay gel protein”, С-реактивного белка (СРБ) методом иммуноферментного анализа (ИФА), креатинина реакцией Иоффе, мочевины УФ-кинетическим уреазным методом, циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) методом фотометрии. У больных РА и ряда больных СКВ исследовался уровень ревматоидного фактора (РФ) методом ИФА. У больных СКВ дополнительно исследовались антитела к ДНК непрямым твердофазным иммуноферментным методом (ELISA) с использованием тест-систем фирмы “Orgentec” и оценкой на многофункциональном анализаторе Victor II (Pribori Oy, Финляндия), у ряда больных определялся титр антинуклеарного фактора (АНФ) иммунофлуоресцентным методом. У больных СКВ с наличием нефрита и больных ХГН сульфосалициловым методом исследовалась суточная протеинурия, рассчитывалась скорость клубочковой фильтрации по формуле Cockoft-Golt.

Определение уровня интерлейкина 2 (ИЛ-2), интерлейкина 6 (ИЛ-6), фактора некроза опухолей ? (ФНО ?), sFas-лиганда (sFas-L), Cu/Zn супероксиддисмутазы (Cu/ZnСОД) проводилось на сенсорном иммуноферментном анализаторе Sunrise (TECAN Austria GmbH) с использованием тест-систем фирмы “Biosourse Europe S.A.”, Бельгия при определении ИЛ-2, ИЛ-6, ФНО-?, Cu/ZnСОД и тест-системы фирмы “Bender Medsystems”, Австрия при определении sFas-L. Минимально определяемыми концентрациями согласно методикам измерений были для ИЛ-2 5,1 пг/мл, для ИЛ-6 2 пг/мл, для ФНО-? 1,7 пг/мл, для sFas-L 0,1 нг/мл, для Cu/ZnСОД 0,07 нг/мл. Показатели ниже уровня детекции принимались равными 0.

Исследование активности апоптоза периферических лимфоцитов

Выделение циркулирующих Лф производилось из гепаринизированной крови в двойном градиенте плотности фиколл-верографина 1,077 и 1,092 г/мл с первоначальным центрифугированием в течение 40 мин при скорости 1500 об/мин с последующим центрифугированием в течение 5 мин при 400 об/мин в градиенте перколла 1,060 г/мл.

Определение характера повреждений ДНК (1- и 2-нитевые разрывы) проводили флуоресцентным методом по изменению параметров флуоресценции двух ДНК-тропных красителей: бромистого этидия (EtBr) (“Sigma”, США) и 4’, 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPY) (“Serva”, США) (Иванов, 1992; Анисимов, Болотников, 1999). Измерения проводили на приборе ФМ-Ц-2 (ЛФ ВНИИМП, Россия. Определение активности каспаз (К) проводили флуоресцентным методом с использованием специфических субстратов, меченных флуоресцентной меткой (7-амино-4-трифлуорометилкумарин – AFC) (“BioRad”, США), детектируемой по изменению флуоресценции или оптической плотности. Определение количества отщепленного AFC проводили на СФ=46 (ЛОМО, Россия) при ? = 395 нм через 30, 60, 90, 120, 150, 180 мин после начала реакции.

Инструментальные методы исследования

Всем больным РА проводилась рентгенография суставов кистей и/ или стоп для определения стадии заболевания согласно классификации Steinbroker. Всем больным СКВ и ХГН проводилось ультразвуковое исследование почек. Дополнительно к вышеперечисленным методам исследования всем больным выполнялось ЭКГ, по показаниям - рентгенологическое исследование органов грудной полости.

Морфологические методы исследования.

Больным СКВ с поражением почек и больным ХГН выполнялась диагностическая нефробиопсия под контролем УЗИ. У всех больных было получено информированное согласие на проведение данного метода обследования. Полученные кусочки (размером 3-4(3-4 мм) фиксировались в течение суток в 1% растворе нейтрального формалина с последующей проводкой и заливкой в парафин общепринятым способом, затем срезы окрашивались гематоксилин-эозином, толлуидиновым синим, на фибрин по Вейгерту и проводилась ШИК-реакция с последующей микроскопией полученных препаратов в гистологической лаборатории ГУЗ “Республиканская больница им. В.А. Баранова”.

Исследование активности апоптоза лимфоцитов периферической крови in vitro под влиянием метилпреднизолона, циклофосфана.

У 25 больных РА, 20 больных СКВ и 20 больных ХГН in vitro исследовали влияние иммуносупрессивных препаратов на активность А Лф. Первоначально определяли исходную активность А Лф. Затем обрабатывали Лф больных, каждая проба в количестве 2х106 Лф, в течение 14 часов в зависимости от заболевания иммуносупрессивными препаратами: при РА – в первой пробе - метилпреднизолоном (концентрация 100 мкМ), во второй пробе - метотрексатом (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе первоначально метилпреднизолоном, в последущем меторексатом в указанных концентрациях; при СКВ и ХГН - в первой пробе - метилпреднизолоном (концентрация 100 мкМ), во второй пробе – циклофосфаном (концентрация 10 мкг/мл), в третьей пробе первоначально метилпреднизолоном, в последущем циклофосфаном в указанных концентрациях. После окончания времени инкубации во всех пробах повторно определяли активность К и количество разрывов ДНК.

Для подтверждения внекаспазного пути активации А Лф 25 больных РА в количестве 2х106 инкубировали в присутствии ингибитора К ZVAD в концентрации 50 мкМ в течение 1 ч при 37 °С с последующей обработкой метотрексатом в концентрация 10 мкг/мл и определением активности К и количества разрывов ДНК. Также Лф 15 больных ХГН в количестве 2х106 инкубировали в присутствии ингибитора К ZVAD в концентрации 50 мкМ в течение 1 ч при 37 °С с последующей обработкой циклофосфаном в концентрация 10 мкг/мл и определением активности К и количества разрывов ДНК.

Статистическая обработка результатов.

Результаты исследования были занесены в таблицу формата Microsoft Excel 2003, затем проводилась статистическая обработка данных при помощи пакета программ Statistica 6.0. Перед началом статистической обработки распределения значений количественных признаков были проверены на нормальность. Проведенный анализ показал, что все количественные признаки имеют нормальное распределение. Определялись средние величины [M+m], достоверность различия средних значений в группах по критерию Стьюдента (t), по критериям знаков и Манна-Уитни для малых выборок. Наличие достоверных различий между группами (p<0,001, p<0,01, p<0,05) обозначено в таблицах знаком *. Изучена теснота связи (корреляция) между клиническими, лабораторными, инструментальными показателями при помощи коэффициента корреляции Пирсона (коэффициент парной корреляции). Влияние отдельных факторов риска (количественных и качественных) на результаты лечения определяли в регрессионном анализе по величине риска отсутствия улучшения, выражавшемся в отношении шансов. Данный показатель отражает во сколько раз риск невозможности достичь улучшения от проводимой базисной терапии выше у пациента с определенным фактором риска по сравнению с тем, у кого этот фактор не определяется.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение активности апоптоза периферических лимфоцитов при заболеваниях иммуновоспалительного генеза – ревматоидном артрите, системной красной волчанке, хроническом гломерулонефрите

Для решения поставленных целей и задач исследовано 172 больных достоверным РА, диагностированным на основании критериев Американской коллегии ревматологов, 129 женщин (75%), 43 мужчины (25%), средний возраст составил 47,4 ± 12,2 лет (максимально 71 год, минимально 19 лет), давность заболевания 43,1±19,7 мес (максимально 8 лет), из них давность заболевания до 6 мес включительно имела место у 45 (26,2%) пациентов, от 6 мес до 1 года – у 62 (36,1%) от 1 года до 2 лет – у 22 (12,8%), от 2 до 5 лет – у 18 (10,5%) и более 5 лет – у 25 (14,4%) . У 75 больных (43,6%) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. У 150 пациентов (87,2%) имел место полиартрит, у 22 (12,8 %) – олигоартрит. Серопозитивный вариант РА имел место в 114 случаях (66,3 %), серонегативный – в 58 (33,7 %). I рентгенологическая стадия была диагностирована у 38 пациентов (22,1%), II – у 48 (27,9%), III – у 38 (22,1%), IV – у 14 (8,1%), у 34 (19,8%) не было выявлено патологических изменений на выполненных рентгенограммах. Активность заболевания определялась согласно критериям, рекомендованным Ассоциацией ревматологов России (АРР), а также по уровню индекса DAS4 согласно критериям EULAR. Наибольшее количество больных составили пациенты с умеренной (76 пациентов (44,2%) по критериям АРР и 77 (44,8%) по критериям EULAR) и высокой (59 пациентов (34,3%) по критериям АРР и 58 (33,7%) по критериям EULAR) степенью активности заболевания. У 37 пациентов (21,5%) и по критериям АРР, и по критериям EULAR была констатирована минимальная степень активности патологического процесса. У всех больных имела место функциональная недостаточность различной выраженности – у 51 пациента (29,7%) I степени, у 62 (36,1%) – II, у 45 (26,2%) – III, у 14 (8,0%) – IV. Системные проявления заболевания отмечены у 105 больных (61,1%).

В исследование включено 85 больных достоверной СКВ, диагностированной на основании критериев Американской коллегии ревматологов, 76 женщин (89,4%), 9 мужчин (10,6%), средний возраст составил 39,1±14,2 лет (максимально 73 года, минимально 16 лет), давность 7,4±6,7 года (максимально 27 лет). У 16 пациентов (18,8%) СКВ диагностирована впервые. У 4 пациентов (4,7%) имело место острое течение заболевания, у 65 (76,5%) – подострое, у 16 (18,8%) – хроническое. У 20 (23,5%) больных имела место минимальная активность заболевания, у 34 (40%) – умеренная, у 31 (36,5%) - высокая. Люпус-нефрит имел место в 38 случаях (44,7 %), в 10 из них (26,3%) верифицированный морфологически, у 5 больных имела место хроническая почечная недостаточность, у 1 больной – в терминальной стадии, в последующем больная получала терапию хроническим гемодиализом. В меньшем проценте случаев встречался полисерозит (у 22 больных), нейролюпус (у 19 пациентов), антифосфолипидный синдром (у 18 больных). Особое внимание в работе уделено группе больных СКВ с наличием люпус-нефрита.

В исследование включено 75 больных ХГН, 50 мужчин (66,7%), 25 женщин (33,3%), средний возраст составил 34,3±14,5 лет (максимально 63 год, минимально 17 лет), давность 4,6±7,1 года (максимально у 1 больного 36 лет). У 48 больных (64 %) на момент включения в исследование заболевание диагностировано впервые. В исследование были включены больные только с активными вариантами ХГН. У 46 пациентов (61,3%) имел место нефротический вариант заболевания, у 20 (26,7%) - смешанный вариант (нефротический синдром, артериальная гипертензия), у 9 (12%) – нефритический синдром. У 40 больных (53,3%) выполнялась нефробиопсия, по результатам которой у 26 больных (34,7%) имел место мезангиопролиферативный вариант заболевания, у 14 (18,6%) – мембранозная нефропатия, у 6 (8%) – экстракапиллярый гломерулонефрит с полулуниями. У 46 больных (61,3%) функция почек была сохранена, у 29 (38,7%) имела место почечная недостаточность различной степени выраженности – у 14 (18,7%) – I, у 9 (12%) – II, у 6 (8%) – III по классификации С.И. Рябова.

Изучена активность К 8, К 6, К 4 и количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК в целом в группах больных РА, СКВ и ХГН на момент включения в исследование в сравнении с контрольной группой здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 1 и на рисунке 1.

Реализация программированной клеточной гибели лимфоцитов в виде 1- и 2-нитевых разрывов ДНК оказалась достоверно выше при всех изучаемых иммуновоспалительных заболеваниях по сравнению со здоровыми донорами, что представлено на рисунке 1.

* - – различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001)

°– различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (° - р < 0,05)

Рисунок 1 – Количество 1- и 2-нитевых разрывов ДНК при РА, СКВ и ХГН

Процесс А осуществляется посредством последовательной активации каскада К. Активность исследуемых К при изучаемых заболеваниях представлена в таблице 1. К 8 - активатор эффекторных К и эффекторная К 6 достоверно более активны при всех изучаемых заболеваниях по сравнению с контрольной группой. К 4 также имеет достоверно более высокую активность, что наиболее вероятно связано не только с ее участием в процессе А, но и с ее ролью активатора цитокинов.

Таблица 1 - Активность К 8, К 6, К 4 и количество разрывов ДНК при РА, СКВ и ХГН

– различия достоверны при сравнении с группой контроля (* - р < 0,05, ** - p < 0,01, *** - p < 0,001)

°– различия достоверны при сравнении между группами больных с различными заболеваниями (° - р < 0,05, °° - р < 0,01) При сравнении активности А Лф при изучаемых заболеваниях выявлено, что активность К 8 несколько ниже при РА по сравнению с СКВ и ХГН при сравнимой активности К 6, К 4 и количеству разрывов ДНК. Отсутствие значимых различий в активности А Лф при различных иммуновоспалительных заболеваниях позволяет предположить более важную роль активности патологического процесса, а не его распространенности.

Процесс А запускается в момент взаимодействия специфического рецептора и его лиганда. Наиболее изученным из индукторов клеточной гибели является Fas-лиганд, вызывающий при взаимодействии со специфическим рецептором Fas/АРО/CD95 А клетки. Растворимый FasL (sFasL) представляет собой фракцию FasL, которая не связана с клетками, циркулирует в крови и может быть определена иммуноферментным методом. В связи с важной ролью FasL в протекании процессов А проведено сравнение активности изучаемых К и количества разрывов ДНК раздельно у sFasL-позитивных и у sFasL-нетагивных больных РА, СКВ, ХГН. Выявлено, что как среди серопозитивных, так и среди серонегативных по sFasL больных, достоверно более высокая активность К 8 и К 6 наблюдается при ХГН, минимальная – при СКВ. Активность К 4 среди серопозитивных по sFasL больных достоверно более высока у больных СКВ и сравнима при РА и ХГН. Активность К 4 среди серонегативных по sFasL больных наименьшая у больных ХГН и сравнима при РА и СКВ. Количество разрывов ДНК у серопозитивных по sFasL больных при РА, СКВ и ХГН не имеет достоверных различий, тогда как у серонегативных по sFasL больных отмечается достоверно большее количество 1-нитевых разрывов ДНК при ХГН при их меньшем и сравнимом количестве при РА и СКВ. Полученные данные позволяют предполагать различную долю участия sFasL в реализации процессов А при различных иммуновоспалительных заболеваниях.

Проведен анализ зависимости активности А Лф от особенностей заболевания – при РА от варианта, активности, длительности, стадии, наличия внесуставных проявлений, наличия и выраженности функциональной недостаточности, при СКВ от варианта течения, давности, активности, наличия нефрита.

Выявлена более высокая активность К и количества разрывов ДНК у больных серопозитивным вариантом РА, с высокой активностью заболевания, при наличии внесуставных проявлений заболевания. Убедительных различий в активности изучаемых К и количестве разрывов ДНК при различных рентгенологических стадиях заболевания не отмечено.

Выявлено, что у больных “ранним РА” (давность заболевания не более 6 мес) имеет место снижение активности К 8 и 6 и количества разрывов ДНК не только по сравнению с больными “неранним РА”, но и по сравнению с группой контроля (результаты представлены на рисунке 2), что может свидетельствовать о депрессии процессов программированной клеточной гибели в дебюте заболевания, что, возможно, и является предрасполагающим фактором для развития РА.

*- различия достоверны при сравнении между группами (p<0,05)

Рисунок 2 - Количество разрывов ДНК при РА в зависимости от давности заболевания


загрузка...