Биохимические механизмы неспецифической защиты клетки от окислительного стресса (06.12.2010)

Автор: Чистяков Владимир Анатольевич

С – концентрация аминокислот в мМ.

Для экспериментального исследования роли топологической организации нуклеиновых кислот при защите от повреждающих агентов использовали систему генерации АФК, позволяющую определить степень разрушения линейных и кольцевых суперспиральных молекул ДНК и суммарной РНК.

В качестве источника линейной хромосомной ДНК и суммарной РНК использовали штамм E.coli АВ 1157. ДНК и РНК выделяли с использованием фенольной депротеинизации, затем разделяли хроматографией на сефарозе 4В («Pharmacia», Швеция). Ковалентно замкнутую кольцевую ДНК выделяли из штамма НВ-101 — носителя плазмиды pBR-322 по методу Кизера (1984).

Для получения гидроксильных радикалов в систему генерации супероксидного аниона, образующегося при аутоокислении гидроксиламина в нитрит, вводили ионы Сu2+. В качестве перехватчика гидроксильных радикалов использовали раствор маннита. Деградацию нуклеиновых кислот in vitro учитывали, измеряя флуоресценцию комплексов нуклеиновых кислот с бромидом этидия.

Для определения способности активных форм кислорода вызывать однонитевые разрывы в ковалентно замкнутых кольцевых ДНК использовали их свойство быстрой ренатурации после щелочной денатурации, применяемое во многих методах выделения ковалентно замкнутых кольцевых ДНК (Кантор, Шиммел, 1984). Определение сводилось к измерению флуоресценции комплекса ДНК-бромид этидия после инкубации при рН=12,3 и последующей нейтрализации до рН = 8,0.

Степень деградации нуклеиновых кислот рассчитывали по формуле:

Fo - флуоресценция опытной пробы нуклеиновой кислоты;

Fk - флуоресценция контрольной пробы нуклеиновой кислоты;

Ff - флуоресценция 0,5 мкг/мл бромистого этидия в соответствующем буфере.

С целью учета поглощения сульфата меди в области 500-700 нм при измерении флуоресценции для каждого буфера в модельных опытах определяли коэффициент гашения флуоресценции ионами меди (k):

FEt - флуоресценция раствора бромистого этидия без CuSO4;

FCu2+ - флуоресценция раствора бромистого этидия в присутствии определенной концентрации CuSO4.

Для определения токсичности металлов в присутствии аскорбата использовали стандартный протокол биолюминесцентного теста на токсичность (Суслов, Данилов, 1996) с использованием рекомбинантного штамма E.coli В 5356. Результаты всех экспериментов с биосенсорами рассчитывали по данным минимум трех измерений. Эксперименты проводили в трех независимых повторностях.

В экспериментах по выживаемости дрожжей после гипербарической оксигенации (ГБО) обрабатывали чашки Петри с полной средой, засеянные исследуемыми культурами. В биохимических экспериментах суспензии дрожжей в полной среде обрабатывали ГБО в пенициллиновых флаконах. Немедленно после обработки клетки отмывали от среды 0,1 М Na фосфатным буфером с рН 7,4.

Во всех биохимических экспериментах дрожжи гомогенизировали по модифицированному методу (Bhaduri, Demchick, 1983). Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК), определяли по методу Ushiyama, Mishara (1978). Определение белка проводили по методу Лоури (Кочетов, 1981). Каталазную активность определяли по методу Баха и Зубковой (Березов, 1976). Определение суммарной пероксидазной активности проводили по методу Ornstein в модификации Лукаша (1995). Определение СОД активности проводили по разработанному нами методу (Чистяков и др., 1991). Биохимические параметры дрожжей рассчитывали по данным 6-7 повторностей.

Материалом для исследования антимутагенной/антиоксидантой активности тканей рыб служили образцы гонад, печени и мышц 12 особей русского осетра Acipenser gueldenstaedti, хряща хорды трех особей севрюги Acipenser stellatus, гонад и печени 35 особей пиленгаса Mugil soiuy, 15 особей чехони Pelecus cultratus, и 5 особей тарани Rutilus rutilus heckeli. Рыбы были выловлены в 1999-2001 гг. в Азовском море. Органы для исследования замораживали до –200 С и доставляли в лабораторию, где измельчали и экстрагировали пятью объемами 96 % этанола. Принцип оценки антимутагенного потенциала, как и в случае аллантоина, был основан на определении способности вещества или экстракта гидробионта подавлять SOS-индукцию, вызванную перекисью водорода у E. сoli.

В экспериментах с ионами Скулачева самцам крыс Wistar (аутбредный сток), в возрасте 45 дней в течение 14 дней вводили SkQ1 по 25 и 250 нмоль/кг в день. Часть крыс после окончания введения препарата подвергли обработке ГБО в режиме 0,5 МПа в течение 60 минут.

Частоту аберраций хромосом определяли в роговице глаза при помощи анафазного теста (Дарлингтон, Ла Кур, 1980). Учитывали хромосомные фрагменты, хроматидные фрагменты, хромосомные и хроматидные мосты. Митотический индекс рассчитывали как процентное отношение числа делящихся клеток к общему числу проанализированных клеток (не менее 3000 для одного глаза). Всего для цитогенетических исследований было сформировано 6 групп по 10 животных.

Для биохимических экспериментов использовали животных с характеристиками, аналогичными вышеописанным, SkQ1 вводили по вышеприведенной схеме. Исследование внеклеточного 8-ОН-2-деоксигуанозина (8-OHdG) проводили в сыворотке крови методом иммуноферментного анализа с использованием тест-системы - DNA Damage ELISA Kit, (Biohem Acquires Assay Designs (США)), на автоматическом анализаторе Alisei (Италия). Число животных в контроле - 18, в опытных группах по 9.

Статистическую обработку проводили по стандартным биометрическим формулам. Для оценки статистической значимости различий использовали t-критерий Стьюдента и непараметрический критерий Уилкоксона (Манна-Уитни) (Лакин, 1990; Владимирский, 1983).

Результаты и их обсуждение

Уровень неорганических соединений:

Оценка протекторных свойств марганца.

Способность некоторых двухвалентных катионов усиливать деструктивное действие АФК — общеизвестный факт. Менее известно то, что еще в 1982 году Арчибальдом и Фридовичем были опубликованы данные о супероксидустраняющей активности ионов марганца (Archibald, Fridovich, 1982). В экспериментах in vitro было обнаружено, что двухвалентный марганец, взаимодействуя с супероксид-анионом и двумя протонами, окисляется до трехвалентного состояния с образованием перекиси водорода (Archibald, Fridovich, 1982). Позже были найдены косвенные доказательства эффективной работы данного цикла у некоторых микроорганизмов. По мнению Дэйли и соавторов (Daly et al., 2007), именно высокое содержание марганца обеспечивает резистентность бактерии Deinococcus radiodurans к дозам радиации, измеряемым десятками кГр. Согласно предположению Дэйли, участие марганца в защите D. radiodurans от радиации указывает как на первичность супероксид-аниона, а не гидроксильного радикала, так и на первичность повреждения белков, а не нуклеиновых кислот, в развитии радиационного повреждения микроорганизмов. Эта гипотеза выглядит несколько избыточной. Логичнее предположить, что ионы марганца способны обеспечивать защиту ДНК, которая, по классическим представлениям, является главной клеточной мишенью для ионизирующих излучений от гидроксильного радикала. Проверка этого предположения была задачей экспериментов, описанных в данной главе.

, 1998). Однако, как видно на рисунке, использование урата в концентрации, близкой к насыщенной (1 мМ), не позволяет достичь характерного для марганца протекторного эффекта. ПЦР проходит неспецифично с образованием размытой высокомолекулярной фракции.

Перекись водорода — необходимый компонент процессов, открытых Фентоном и детально изученных Габером и Вейссом. Побочным продуктом фентоновских процессов является гидроксильный радикал, способный эффективно разрушать ДНК (Водолажский и др., 1987).

Рис. 1. Электрофореграммы продуктов амплификации нативной и обработанной АФК ДНК

а) 1; 8 – нативная ДНК; 2 — FeSO4 0,8125 мМ; 3 — H2O2 1,25 %; 4 — FeSO4, 0,8125 мМ и H2O2 1,25 %; 5 — FeSO4, 0,8125 мМ, H2O2, 1,25 % и MnSO4 8,125 мМ; 6 — FeSO4, 0,8125 мМ , H2O2 1,25 % и MnSO4 0,8125 мМ; 7 — FeSO4 0,8125 мМ, H2O2 1,25 % и MnSO4 0,08125 мМ; K— негативный контроль.

б) Обозначения дорожек 1 – 6 и 8 аналогичны рис. а, 7 — FeSO4, 0,8125 мМ и H2O2 1,25 % и 1 мМ урата.

Данные об участии ионов марганца в фентоновских процессах достаточно противоречивы. С одной стороны, их комплексы с органическими молекулами катализируют разложение перекиси водорода, что должно, также как и перехват супероксид-аниона, тормозить развитие реакций генерации АФК (Berlett et al., 1990). Но, с другой стороны, процесс разложения перекиси в присутствии марганца также может идти по свободно-радикальному механизму. В работе Mendez-Alvarez и др. (2001) отмечено 72 % снижение уровня генерации гидроксильного радикала и 17 % снижение количества перекиси водорода, образующихся при автоокислении 6-гидроксидофамина.

Наши эксперименты показали, что в условиях, близких к физиологическим, марганец катализирует реакции, ведущие к уменьшению свободно-радикального разрушения ДНК.

Эффективность действия марганца как антиоксиданта/антимутагена может быть проиллюстрирована тем, что MnSO4 в концентрациях 10 и 100 мМ подавляет генотоксичность перекиси водорода в концентрации 10-5 M на 75,7 % и 87,2 %, соответственно. Концентрация MnSO4 1 мМ не дает протекторного эффекта (рис. 2).

Таким образом, способность ионов марганца защищать ДНК от разрушения в фентоновских процессах проявляется и в форме подавления генотоксичности перекиси водорода. По-видимому, накопление марганца бактериями позволяет им не только имитировать супероксиддисмутазную активность, но и формировать целый комплекс защитных механизмов, которые обеспечивают как удаление супероксид-аниона, так и защиту ДНК от агрессивных продуктов фентоновских процессов, в первую очередь, от гидроксильного радикала.

Рис. 2. Индукция SOS-ответа E. coli перекисью водорода в концентрации 10-5 M в присутствии сульфата марганца

ДНК-протекторные свойства солей марганца были использованы нами для создания методики консервации образцов ДНК внутри пластиковых пленок (Чистяков и др., 2007; 2009). Эта методика позволяет при помощи стандартного офисного ламинатора формировать компактные пакеты архивных образцов ДНК, защищенных, в отличие от FTA-карт, от избытка влажности, потравы насекомыми и т.д.

Уровень низкомолекулярных органических соединений: участие азотсодержащих низкомолекулярных соединений в защите от окислительного стресса

Исследования последних десятилетий выявили целый ряд веществ, специфической функцией которых является защита клетки от АФК. Менее изучены антиоксидантные свойства веществ, основная функция которых, по существующим представлениям, не связана с защитой от кислорода. Весьма интересны в этом плане азотсодержащие соединения, наиболее изученным представителем которых является мочевая кислота. Непосредственным катаболитом урата у большинства позвоночных, за исключением приматов, является аллантоин, и, таким образом, вопрос об антиоксидантной способности аллантоина представляет несомненный интерес. Квантово-химические расчеты, проведенные Корниенко с соавт. (2002), позволили предположить у некоторых аминокислот способность реагировать с супероксид-анионом.

Таким образом, задачей данного раздела работы было исследование антиоксидантной активности аллантоина, урата и аминокислот.

Аллантоин, урат. Как видно из результатов, представленных в табл. 1, аллантоин и аскорбат проявляют способность супрессировать вызванную перекисью водорода SOS-индукцию. При этом максимальная активность аллантоина регистрируется для концентрации 10-4 М, а аскорбата - 10-2 М. Кроме того, антимутагенная активность аллантоина сохраняется и для малых концентраций – 10-10 и 10-9 М, в которых аскорбат начинает усиливать SOS-индукцию, вызванную перекисью. Данное явление связано, по-видимому, со взаимодействием аскорбата, перекиси и железа, присутствующих в питательной среде для бактерий. Рассматривая результаты эксперимента в целом, отметим, что оба исследованные соединения обладают способностью подавлять генотоксическое действие перекиси водорода.

Подавление аллантоином как мутагенеза, так и SOS-ответа, развивающегося под действием перекиси водорода, указывает на способность этого вещества непосредственно защищать ДНК от деструктивного действия гидроксильного радикала, что характерно и для мочевой кислоты. При этом максимальный антимутагенный эффект проявляется при введении аллантоина за 1,5 часа до обработки. Отсутствие достоверного защитного эффекта при одновременном введении перекиси и аллантоина, по-видимому, объясняется разными скоростями проникновения этих веществ в клетку.


загрузка...