Штаммы Vibrio cholera с измененной экспрессией генов вирулентности (06.07.2009)

Автор: Заднова Светлана Петровна

Авирулентные штаммы (ctxA-, tcpA-)

М-1420 + - - 0,0 -

1132 - + - 0,0 -

Р-18751 - + - 0,0 -

М-885 - + - 0,0 -

М-998 - + + 0,0 -

М-999 - + + 0,0 -

С-197 - - + 0,0 -

230 - - - 0,0 -

КМ115 - - - 0,0 -

Примечание: *- по данным ПЦР и реакции агглютинации с диагностическими холерными О-сыворотками тестируемые штаммы относятся к следующим серогруппам и сероварам: 569В, Р-3644, М-1429, М-964, М-1420 – О1 серогруппа серовар Инаба; 34 Филип., М-1260, М-1430, 18797, 18796, 1132, Р-18751, М-885, М-998, М-999 – О1 серогруппа серовар Огава; Р-16064, МО-45, 230, КМ115 – О139 серогруппа; С-197 – неО1/неО139 серогруппа.

Вместе с тем было выявлено три штамма (М-999, М-998, С-197), у которых отсутствовал ген tcpA, но результаты ДИА были положительными (таблица 6). Согласно литературным данным у tcpA- холерных вибрионов могут присутствовать пили, подобные ТСР (Fullner, Mekalanos, 1999). Можно полагать, что данные штаммы синтезируют новый тип пилей, имеющих сходную с ТСР последовательность белка. Эти данные расширяют наши представления о дополнительных факторах патогенности холерного вибриона и указывают на возможность использования созданной тест-системы при анализе атипичных штаммов V. cholerae, все чаще вызывающих вспышки или спорадические случаи холеры.

На следующем этапе сконструированную тест-систему использовали для анализа двух производственных серий холерной химической бивалентной вакцины «холероген-анатоксин+О антиген». Ранее было установлено, что эта вакцина содержит О1 антиген сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицу в составе инактивированного СТ (Джапаридзе с соавт., 1991). Присутствие указанных антигенов в вакцине обеспечивает формирование антибактериального и антитоксического иммунитета. В тоже время из-за отсутствия антисыворотки к ТСР не было сведений о наличии этого антигена в указанной вакцине. Полученные нами данные подтвердили присутствие в составе вакцины О1 антигена сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицы СТ. Однако проверяемая вакцина не содержала ТСР.

Итак, диагностическая ценность предлагаемой тест-системы заключается в следующем. Во-первых, обнаружение продукции О антигена позволяет судить о выделении штамма холерного вибриона О1 серогруппы. Во-вторых, на основе изучения экспрессии СТ и ТСР возможна оценка вирулентности выделенных штаммов. В-третьих, созданная тест-система может быть использована при анализе атипичных штаммов V. cholerae, способных вызывать вспышки и спорадические случаи холеры.

В заключении подведены итоги работы и определены перспективы дальнейших исследований. Отмечено, что новые сведения, о существовании в популяции ряда штаммов возбудителя холеры двух типов клонов, различающихся уровнем экспрессии одновременно нескольких генов вирулентности и персистенции, а также выяснение роли отдельных факторов внешней среды в переключении активности этих генов, может внести существенный вклад в понимание природы адаптационной изменчивости V. cholerae, поскольку является одним из перспективных направлений дальнейших исследований по проблеме холера и позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации.

Не менее важны приоритетные данные о влиянии рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности СТХ и RS1, на экспрессию хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, а также контролирующих процессы метаболизма, энергетического обмена, транспорта, цитокинезиса и продукцию белков внешней мембраны, путем изменения активности глобального регуляторного гена toxR. Полученные результаты свидетельствуют о существовании ранее неизвестного механизма координированного изменения активности различных генов и указывают на перспективы продолжения исследований, направленных на получение новых фундаментальных знаний о роли чужеродного генетического материала в изменении экспрессии резидентных генов возбудителя холеры.

Наряду с фундаментальным аспектом, работа имеет и важное практическое значение. Сконструированные бесплазмидные и содержащие плазмиду рСТ105::mini-kan штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией ряда факторов патогенности и иммуногенности холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, белок внешней мембраны, ферменты патогенности, О1 антиген) могут быть использованы в производстве более эффективных холерных профилактических и диагностических препаратов. Созданная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система будет востребована при проведении мониторинговых исследований и уточнения эпидемической значимости штаммов холерного вибриона.

1. При комплексном фенотипическом анализе 146 клинических штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров обнаружены штаммы, гетерогенность популяции которых определяется присутствием двух типов клонов, различающихся по морфологии колоний (мутные и прозрачные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Впервые установлено, что экспрессия генов, контролирующих указанные фенотипические свойства, имеет координированный характер.

2. Морфология колоний штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров определяется биосинтезом экзополисахарида. Впервые обнаружено, что классические и эльтор вибрионы, продуцирующие экзополисахарид, различаются по характеру координированной экспрессии генов холерного токсина (сtxAB), растворимой гемагглютинин/протеазы (hapА) и подвижности (mot). У эльтор вибрионов повышение экспрессии генов экзополисахарида (vps) сопровождается увеличением активности генов сtxAB, но снижением экспрессии генов hapА и mot. У классических вибрионов существует обратная связь между экспрессией указанных генов.

3. Впервые показано, что в состав экзополисахарида V. cholerae классического биовара входят рамноза, глюкоза, галактоза и гексозамин. Выявлена адаптивная функция экзополисахарида, заключающаяся в повышении устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов.

4. Проведенный сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара выявил присутствие 841 белка. В клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Тох++Нар+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

5. Сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности является щелочная реакция среды (рН 9,0). Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Введение рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 в клетки высокотоксигенных штаммов V. cholerae классического биовара приводит к выраженному изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, – токсин-корегулируемые пили адгезии и белок OmpU. Изменение экспрессии хромосомных генов обусловлено повышенной активностью глобального регуляторного гена toxR.

7. При сравнительном анализе протеомов исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae впервые выявлены различия в их белковых профилях. В штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду, обнаружено 33 гена с пониженной и 28 генов с повышенной экспрессией, кодирующих белки, являющиеся важными факторами вирулентности и иммуногенности, а также участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, транспорте, цитокинезисе и входящих в состав внешней мембраны.

8. Сконструированы содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена, ответственных за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Определены оптимальные условия их культивирования (фаза роста, температура, состав и рН среды, время выращивания) для получения протективных антигенов при малообъемном культивировании в производственных условиях.

9. На основе сконструированных штаммов создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, включающая набор из 4-х очищенных протективных антигенов (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1 антигена сероваров Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Экспериментально доказана специфичность, эффективность и диагностическая ценность тест-системы при определении экспрессии основных генов патогенности и иммуногенности у природных штаммов V. cholerae с различной эпидемической значимостью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

Заднова С. П. Сравнительный анализ факторов патогенности у токсигенных и нетоксигенных клонов штаммов Vibrio cholerae Дакка35 Огава / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 1999. – Вып. 79. – С. 153–159.

Чеховская Г. В. Новый высокотоксигенный штамм Vibrio cholerae Дакка35: морфология, продукция холерного токсина и белковый спектр / Г. В. Чеховская, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, Ю. В. Лазовский, Н. И. Смирнова // Centre for Control and Research of natural infectious diseases. Scientific Journal. – Ulaanbaatar, 1999. – N 7. – P. 282–283.

Konnov N. P. Comparative microscopy study of Vibrio cholera flagella / N. P. Konnov, V. B. Baibyrin, S. P. Zadnova, Y. P. Volkov // International Symposium. Biomedical Optic, Spie Proceedings. – San Jose, USA, 1999. – Vol. 3607. – P - 25. – S. 30–31.

Топорков А. В. Штаммы холерного вибриона с повышенной продукцией токсин-корегулируемых пилей адгезии: выявление и фенотипический анализ / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2000. – Вып. 80. – С .88–93.

Топорков А. В. ToxR-регулируемые гены и их экспрессия в штаммах Vibrio cholerae О1 (рСТ105::mini-kan) / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Г. А. Ерошенко, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (46.00). – Ростов-на-Дону, 2000. – Вып. 13. – С. 59–61.

Смирнова Н. И. Молекулярно- генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 году / Н. И. Смирнова, Н. Б. Челдышова, С. П. Заднова, В. В. Кутырев // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. – 2001. – № 4. – С. 12–16.

Заднова С. П. Получение и фенотипический анализ штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией основных протективных антигенов / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2001. – № 2. – C. 3–6.

Заднова С. П. Получение и изучение антител против токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона О1 серогруппы / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2001. – Вып. 1(81). – С. 131–136.

Заднова С. П. Изучение продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии у штаммов холерного вибриона классического биовара / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Сб. тез. Международной научно-практической конференции. – Алматы, 2001. – Вып. 3. – С. 143–147.

Заднова С. П. Продукция токсин-корегулируемых пилей адгезии природными штаммами холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Ростов-на-Дону, 2001. – Вып. 14. – С. 36–38.

Заднова С. П. Конструирование штаммов-суперпродуцентов токсин-корегулируемых пилей адгезии – основного фактора колонизации холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Биотехнология. – 2002. – № 2. – С. 3–11.

Коннов Н. П. Изучение токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона методом иммуноэлектронной микроскопии / Н. П. Коннов, С. П. Заднова, О. В. Новикова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // ЭМ’2002. Тез. докл. ХIХ Российской конференции по электронной микроскопии. – Черноголовка, 2002. – C. 229.


загрузка...