Штаммы Vibrio cholera с измененной экспрессией генов вирулентности (06.07.2009)

Автор: Заднова Светлана Петровна

КМ220 [КM200 (рСТ105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 42,0±2,1 ++++ + +

J-89 2,0±0,5 - + +

J-89 (pCT105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 6,2±1,2 - + +

M-19 4,2±2,0 - - +

M-19 (pCT105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 12,5±2,3 - - +

В-1307 3,0±0,5 - + +

В-1307 (рСТ105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 8,0±1,0 - + +

Дакка 35 (рСТ(27) Tcr 48,0± 3,0 - следы +

569В(рСТ(27) Tcr 45,0±2,0 - следы +

Примечание: * - штамм V. cholerae 2414 депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ197;

?), включающая плазмиду pOX38 (производная F-фактора, утратившего все известные IS-элементы), и pCT105::mini-kan (TcrKmr), производную pBR322, содержащую ген устойчивости к тетрациклину, транспозон mini-kan и вставку ДНК штамма V. cholerae RV79 биовара эльтор размером 7,0 т.п.н. с клонированными генами профагов СТХ и RS1 (Гинцбург с соавт., 1984). В состав клонированного фрагмента СТХ входят часть гена orfU и гены ace, zot, ctxAB, кодирующие биосинтез 3-х различных токсинов. Профаг RS1, помимо генов rstA, rstB и rstR, содержит ген-антирепрессор rstC, который индуцирует транскрипцию фагового генома, включая гены ctxAB (Гинцбург с соавт., 1984, Смирнова с соавт., 2001, Davis et al., 2002), что приводит к повышению продукции СТ. Частота переноса плазмиды рСО107-2 в клетки V. cholerae классического биовара составила 5x10-7. При введении плазмиды рСО107-2 происходило разъединение коинтеграта и сохранение лишь плазмиды рСT105::mini-kan (TcrKmr). Данные блот-гибридизации тотальной ДНК штаммов V. cholerae, обработанной рестриктазой PstI, с СТ-зондом подтвердили присутствие в созданных штаммах 3-х копий генов холерного токсина, две из которых входили в состав двух хромосом, а одна (размером 7,0 т.п.н.) была локализована на плазмидном репликоне (рисунок 6, дорожки 3 и 5).

Обозначения: 1 - V. cholerae Дакка 35 (исходный); 2 - V. cholerae КМ206 KmsTcs; 3 - V. cholerae 2414 [Дакка 35 (рСT105::mini-kan)]; 4 - V. сholerae 569В (исходный); 5 - V. сholerae 2415 [569В (рСT105::mini-kan)]; 6 - V. сholerae КМ207 KmsTcs. Стрелками отмечены хромосомные(5,6 и 9,0 т.п.н.) и плазмидные (7,0 т.п.н.) копии структурных генов холерного токсина.

Рисунок 6 - Блот-гибридизация тотальной ДНК штаммов V. cholerae, обработанной рестриктазой PstI, с СТ-зондом.

Значительное повышение уровня биосинтеза холерного токсина обусловлено присутствием в штаммах дополнительной копии структурных генов ctxAB, которые находятся на плазмиде и эффективно экспрессируются. Более того, не исключено, что в присутствии гена rstC, которого лишены природные штаммы классических холерных вибрионов, происходит повышение транскрипции их резидентных генов ctxAB, что полностью согласуется с недавно полученными сведениями (Davis et al., 2002).

Последующий анализ трансконьюгантов показал, что только у производных высокотоксигенных штаммов V. cholerae 2414 [Дакка 35 (рСT105::mini-kan)], 2415 [569В (рСT105::mini-kan)] и КМ220 [КM200 (рСТ105::mini-kan)] увеличилась и продукция ТСР (таблица 3), что была подтверждено методами иммуноблоттинга и электронной микроскопии.

Таким образом, основной итог экспериментальной работы - обнаружение ранее не известного влияния рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, содержащей клонированные гены ctxAB и rstC, на биосинтез ТСР у изученных штаммов V. cholerae классического биовара. Из этого следует, что нами выявлен достаточно простой способ создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции основных факторов вирулентности и иммуногенности – СТ и ТСР, состоящий во введении в клетки этого возбудителя указанной плазмиды.

Получение штаммов с повышенным биосинтезом одновременно двух белков, выполняющих ряд важнейших функций в клетке холерного вибриона, ставит вопрос, за счет какого механизма рекомбинантная плазмида, не имеющая клонированных генов tcpA-F, изменяет продукцию ТСР? Поскольку экспрессия генов ctxAB и tсpA-F контролируется одним и тем же регуляторным геном toxR, мы предположили, что наблюдаемое увеличение продукции ТСР у штаммов, содержащих плазмиду, могло быть связано с увеличением активности данного белка-регулятора. В этом случае содержащие плазмиду штаммы должны отличаться от исходных и измененной продукцией белков внешней мембраны OmpU и OmpT, экспрессия которых непосредственно контролируется ТoxR. При анализе полученных изогенных штаммов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле было показано, что продукция белков OmpU и OmpT в присутствии плазмиды существенно изменяется только в штаммах V. cholerae 2414 TcrKmr и 2415 TcrKmr. Исходные штаммы Дакка 35 и 569В синтезируют белок OmpT, экспрессия генов которого негативно регулируется белком ТoxR, и лишь следы OmpU, позитивно контролируемого этим белком. В то же время их содержащие плазмиду штаммы продуцируют значительное количество белка OmpU (таблица 3). Появление у содержащих плазмиду штаммов белка OmpU указывает на то, что в их клетках экспрессия регуляторного гена toxR действительно повысилась. Это обстоятельство, в свою очередь, обусловило, по-видимому, повышение продукции ТохТ, который на завершающей стадии каскадной регуляции увеличил активность генов tcpA-F, что привело к увеличению уровня биосинтеза ТСР. Участие ТoxR в повышении экспрессии ctxAB и tcpA-F в экспериментальных штаммах было подтверждено при их культивировании в непермиссивных для продукции ТoxR условиях.

Далее, для дальнейшего подтверждения участия гена toxR в изменении уровня биосинтеза ТСР в плазмидных штаммах в эксперименты был взят штамм V. cholerae RV31, имеющий делецию в гене toxR. Введение в клетки этого штамма плазмиды рСТ105::mini-kan и последующее определение у полученных трансконьюгантов продукции ТСР и OmpU показало отсутствие у них указанных белков. Эти данные указывают на справедливость нашего утверждения относительно усиления транскрипции гена toxR в штаммах, содержащих рекомбинантную плазмиду и имеющих полноценный ген toxR.

Таким образом, у возбудителя холеры классического биовара обнаружен новый механизм регуляции генной активности, основанный на влиянии плазмидного генома, содержащего клонированные гены двух профагов вирулентности на экспрессию хромосомных генов. Показано, что в присутствии рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan в токсигенных штаммах V. cholerae классического биовара повышается экспрессия хромосомных генов tcpA-F и ompU, кодирующих соответственно биосинтез ТСР и ОmpU, в результате усиления активности регуляторного гена toxR.

Возникает вопрос о том, какие гены клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды могут изменять экспрессию хромосомного гена toxR? Одно из возможных предположений состояло в том, что в таких событиях может играть большую роль второй профаг - RS1, входящий в состав клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды. Внесение в клетки классических вибрионов ДНК профага RS1 в составе рекомбинантной плазмиды могло привести к индукции в чужом хозяине экспрессии гетерологичного гена toxR. Данные, позволившие подтвердить это предположение, были получены в экспериментах при использовании другой рекомбинантной плазмиды рСТ(27 (Тсr), являющейся также производной pBR322, но лишенной в отличие от плазмиды рСТ105 умеренного фага RS1, и несущей делецию протяженностью 250 п.н. в гене ctxA. Оказалось, что введение указанной плазмиды в клетки штаммов V. cholerae 569В и Дакка 35 не приводит к изменению у трансконьюгантов продукции ТСР. Более того, у полученных штаммов V. cholerae Дакка 35 (рСТ(27) и 569В (рСТ(27) было выявлено отсутствие по сравнению с исходными штаммами каких-либо изменений в биосинтезе белков OmpU и OmpT. Повысилась лишь в 2-3 раза продукция В-субъединицы СТ за счет наличия в клетках дополнительных структурных генов ctxB (таблица 3). Таким образом, эти эксперименты, во-первых, подтвердили данные других авторов (Fando et al., 1997; Provenzano et al., 2001; Wibbenmeyer et al., 2002) об отсутствии влияния плазмиды pBR322 на активность гена toxR, во-вторых, свидетельствуют о том, что отсутствие описанных выше различий в продукции ТСР и белков внешней мембраны (OmpU и OmpТ) между исходными и содержащими плазмиду штаммами V. cholerae Дакка 35 (рСТ(27) и 569В (рСТ(27) может быть обусловлена тем, что рекомбинантная плазмида рСТ(27 лишена профага RS1. Из этих данных следует, что этот профаг, возможно, несет ответственность за повышение экспрессии гена toxR. В качестве одного из первых претендентов на участие в этом событии следует рассматривать ген rstC, локализованный в составе RS1. Однако для окончательного заключения о роли гена-антирепрессора rstC в изменении экспрессии хромосомных генов, необходимы дальнейшие исследования.

Итак, нами обнаружено, что введение в клетки возбудителя холеры классического биовара плазмидного генома с клонированными генами двух профагов может включаться дополнительный механизм регуляции хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенности. Перспективность продолжения работы в этом направлении определяется не только получением новых фундаментальных знаний о регуляции экспрессии различных генов патогенности возбудителя холеры, но и ее непосредственной практической ценностью. Во-первых, на основании полученных данных показана возможность использования принципиально нового подхода для создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции одновременно трех важнейших белков – СТ, ТСР и белка OmpU. Во-вторых, созданные штаммы с гиперпродукцией протективных антигенов могут быть использованы для совершенствования выпускаемой в России химической холерной вакцины «холероген–анатоксин+О антиген», а также для выделения очищенных антигенов, необходимых для конструирования диагностических тест – систем.

5. Сравнительный протеомный анализ исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae классического биовара.

Вполне очевидно, что при введении плазмиды рСТ105::mini-kan, наряду с повышенной активностью регуляторного гена toxR, может происходить изменение экспрессии и других хромосомных генов, кодирующих белки с различной функцией. Так, в 2003 г J. Bina et al. показали, что белок ToxR оказывает значительное влияние на метаболизм клетки. При мутации в toxR происходит изменение экспрессии 154 генов, из которых 60 индуцируется, а 94 репрессируется. Обнаружено изменение экспрессии генов, кодирующих белки внешней мембраны, участвующие в транспортных и энергетических процессах, метаболизме железа, подвижности, а также с неустановленной функцией. Эти данные позволяют полагать, что в клетках сконструированных нами штаммах, содержащих плазмиду рСТ105::mini-kan, также может изменяться экспрессия ряда хромосомных генов. В этой связи был проведен сравнительный анализ протеомов исходного штамма V. cholerae 569В и его производного V. cholerae 2415 (рСТ105::mini-kan) TcrKmr. При сопоставлении протеомных профилей сравниваемых штаммов было выявлено 783 белка и обнаружено изменение содержания 61 белка (рисунок 7). Большинство из них, так или иначе, связано с метаболизмом клетки (триптофаназа), ее энергетическим обменом (ацетат киназа), а также транспортными (С4-дикарбоксилат-связывающий белок) и секреторными (MshL, OmpT) функциями (таблица 4).

Наибольший интерес вызывает существенное повышение (в 11,9-19,8 раз) в клетках штамма V. cholerae 2415 TcrKmr белка патогенности – А субъединицы холерного токсина (таблица 4). По данным иммуноферментного анализа уровень продукции секретируемого СТ, в состав которого входит А субъединица, в штамме V. cholerae 2415 TcrKmr увеличился лишь 4,3 раза (таблица 3). Одно из возможных объяснений различий между секретируемой и связанной с клеткой А субъединицей может состоять в отсутствии перестройки в работе системы секреции II типа, через которую происходит транспорт СТ из клетки, при введении плазмиды рСТ105::mini-kan.

Обозначения: 209 – белок MshL; 444 - белок OmpT; 495 - белок цитоплазматической мембраны FtsZ; 583 и 585 – С4-дикарбоксилат связывающий периплазматический белок; 369 – триптофаназа; 401 – ацетаткиназа; 650 и 694 – А субъединица холерного токсина.

Рисунок 7 - Протеинограмма исходного штамма V. cholerae 569В (А) и его производного V. cholerae 2415 TcrKmr, содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan, (Б) с идентифицированными белками.

Таблица 4 - Идентифицированные белки в изогенных штаммах V. cholerae 569B и 2415 (рСТ105::mini-kan).

белка на геле Название

белка Молекулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка в штамме 2415 по сравнению с 569В

209 MshL 60098 Белок внешней мембраны: секреция + 8,0

369 Триптофаназа 52887 Метаболизм - 5,6

401 Ацетат киназа 42816 Энергетический обмен: ферментация + 8,0

444 OmpT 37145 Белок внешней мембраны: порин - 12,0

495 FtsZ 41502 Цитокинезис + 5,6

583, 585 C4-дикарбоксилат-связывающий белок 37072 Транспорт белков, кислот, углеводов - 10,0 - 15,0

650, 694 А субъединица СТ 29317 Патогенез + 11,9; + 19,8

Примечания: «+» - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное число раз, «-» - уменьшение.

Полученные нами при протеомном анализе результаты согласуются с данными J. Bina et al. (2003), относительно изменения продукции ацетаткиназы, транспортных и белков внешней мембраны при изменении активности toxR, и подтверждают выявленную нами роль глобального регуляторного белка ToxR в изменении экспрессии хромосомных генов в штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, присутствие плазмиды рСТ105::mini-kan, содержащей клонированные гены профагов CTX и RS1, в высокотоксигенном штамме V. cholerae 569В в результате повышения активности toxR привело не только к увеличению продукции факторов патогенности СТ и ТСР, но и значительно изменило метаболизм клетки, что выразилось в изменении содержания более 60 белков, участвующих в энергетическом обмене, делении клеток, транспорте, а также входящих в состав внешней мембраны.

5. Создание экспериментальной многокомпонентной иммуноферментной диагностической тест-системы.


загрузка...