Штаммы Vibrio cholera с измененной экспрессией генов вирулентности (06.07.2009)

Автор: Заднова Светлана Петровна

Рисунок 4 - Электронно-микроскопическая фотография двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35, окрашенных рутением красным.

Далее, экзополисахаридный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35. В препарате, полученным из О Тох+Нар++Mot++ вариантов, содержание полисахаридов составило 70 мкг/мл, а из Т Тох++Нар+Mot+ – 40 мкг/мл. Присутствие полисахаридов в препарате, выделенным из О Тох+Нар++Mot++ варианта, было подтверждено методом ВЭЖХ. Проведение сравнительного анализа моносахаридного состава экзополисахарида О Тох+Нар++Mot++ вариантов методом ТСХ при сравнении со стандартными углеводными метчиками показало присутствие в нем рамнозы, глюкозы, галактозы, гексозамина. В то же время в препарате, полученном из Т Тох++Нар+Mot+ вариантов, указанные моносахара присутствовали в следовых количествах. Согласно данным F. H. Yildiz и G. K. Schoolnik (1999) в составе EPS ругозных колоний V. cholerae биовара эльтор, помимо глюкозы и галактозы входят глюкозамин и манноза, отсутствующие в EPS классических вибрионов.

На основе полученных данных о выраженной продукции экзополисахарида O-клонами классических и эльтор вибрионов их фенотип был обозначен как EPS++, а T клонов - как EPS+.

Для выяснения функциональной роли экзополисахарида был проведен сравнительный анализ резистентности EPS++Тох+Нар++Mot++ и EPS+Тох++Нар+Mot+ клонов модельного штамма к действию неблагоприятных факторов внешней среды. В качестве стрессовых факторов использовались высокие концентрации NaCl (2,5 М), а также перекись водорода (20 мМ). В результате было обнаружено, что EPS++Тох+Нар++Mot++ варианты V. cholerae Дакка 35 более устойчивы к действию высоких концентраций соли и перекиси водорода по сравнению с EPS+Тох++Нар+Mot+. Эти сведения указывают на то, что продукция экзополисахарида холерными вибрионами классического биовара происходит, видимо, в результате их адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

3. Сравнительный анализ протеомов фенотипически разных вариантов V. cholerae классического биовара и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение экспрессии генов вирулентности и персистентности.

Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия факторов вирулентности и персистенции контролируется несколькими глобальными регуляторными системами, то изменение активности генов вирулентности может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями. В этой был проведен двумерный гель-электрофорез белковых экстрактов клеток двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35. При компьютерном анализе протеомных карт был выявлен 841 белок. При сопоставлении протеомных профилей двух фенотипически разных вариантов были обнаружены 57 белков, экспрессия которых у EPS+Тох++Нар+Mot+ клонов была либо значительно выше, либо существенно ниже, чем у EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов. Оказалось, что в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов репрессировался синтез 26 белков и индуцировался синтез 31, тогда как в клетках EPS+Тох++Нар+Mot+ наблюдалась обратная картина. Для идентификации было выбрано 19 белков, экспрессия которых между двумя вариантами отличалась в 3,0 и более раз. Среди белков, содержание которых было повышено в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов, большой интерес представляли мембранные (OmpU, TolC) и цитоплазматические (с нитроредуктазной и антиоксидантной функцией) белки, которые обеспечивают защиту клеток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды (рисунок 5, таблица 2). Более того, повышение в EPS++Тох+Нар++Mot+ вариантах более чем в 13 раз концентрации белка OmpU, но снижение почти в 5 раз содержания белка OmpT, биосинтез которых непосредственно контролируется глобальным регуляторным геном toxR, служит в пользу предположения о возможном участии этого гена не только в координированном изменении уровня экспрессии различных генов патогенности, но и других генов, обеспечивающих жизнеспособность клеток.

Обозначения: 62,63,65 – NADH-оксидаза; 125,127,130 – фосфоенолпируват карбоксикиназа; 273 – белок внешней мембраны TolC; 280,288 – аланиндегидрогеназа; 500,541,566 – OmpU; 513, 517 – иммуногенный белок; 518 – белок внешней мембраны OmpT; 658 – кислород-нечувствительная NAD(P)H нитроредуктаза; 709 – антиоксидант, семейства AhpC/Tsa; 709 – метилтрансфераза;791 – фрагмент OmpU; 841 – не идентифицированный белок.

Рисунок 5 - Протеинограмма EPS+Тох++Нар+Mot+ (А) и EPS++Тох+Нар++Mot++ (Б) вариантов V. cholerae Дакка 35 с идентифицированными белками.

Таблица 2 - Идентифицированные белки в штамме V. cholerae Дакка 35.

№ белка на геле Название белка Моле-кулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка у EPS++ вариантов в сравнении с EPS+

62,63, 65 NADH-оксидаза 61874 Энергетический обмен + 5,7; + 8,9; + 32,6

125, 127, 130 Фосфоенолпируват карбоксикиназа 59806 Энергетический обмен: гликолиз - 7,5; - 9,8; - 14,8

273 Белок TolC 47722 Метаболизм белков: секреция и транспорт + 2,2

280, 288 Аланин-дегидрогеназа 39814 Метаболизм - 11,4; - 5,6

500, 541, 566 OmpU 36624 Белок внешней мембраны, защитная + 13,2; + 6,6; + 2,8

513, 517 Иммуногенный белок 35233 Белок внешней мембраны: другие - 11,1; отсутствует у EPS++

518 OmpT 37145 Белок-порин внешней мембраны - 4,8

658 Кислород-нечувствительная NAD(P)H нитроредуктаза 24063 Клеточные процессы: детоксикация + 6,4

709 Антиоксидант, семейства AhpC/Tsa 22847 Клеточные процессы: детоксикация отсутствует у EPS+

709 Метилтрансфераза 23322 Белковый синтез отсутствует у EPS+

791 Фрагмент OmpU 36624 Белок внешней мембраны, защитная +3,4

841 Не идентифицированный белок 13127 Не установлена + 4,1

Примечание: «+» - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное количество раз, «-» - уменьшение.

Таким образом, данные, полученные с помощью протеомного анализа, свидетельствуют о том, что смена фенотипа изучаемых клонов V. cholerae сопровождается значительным изменением клеточного метаболизма.

Следующий этап работы был посвящен выявлению сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии факторов вирулентности и персистенции в штаммах холерного вибриона классического биовара. В результате установлено, что только при культивировании на средах с щелочной реакцией среды (pH 9,0) в популяции EPS+Тох++Нар+Mot+ вариантов V. cholerae Дакка 35, 9361, B-1307 и 49520 с частотой 80-85 % происходило появление вариантов с координированным альтернативным изменением уровня экспрессии генов, определяющих продукцию холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, экзополисахарида, а также подвижности, что приводило к смене их фенотипа.

Смена популяционного состава штамма должна, видимо, привести к изменению уровня его вирулентности. Действительно, при изучении вирулентности двух изогенных клонов V. cholerae Дакка 35 на модельных лабораторных животных было установлено, что EPS+Тох++Нар+Mot+ клоны были вирулентны, а EPS++Тох+Нар++Mot++ - авирулентны. Тем не менее, среди изолированных колоний EPS++Тох+Нар++Mot++ варианта, полученных после рассева содержимого кишечника на плотные среды, фенотип 6,0 % (от общего числа проверенных колоний) был очень сходен с таковым клонов EPS+Тох++Нар+Mot+, что свидетельствует о возможности реверсии нетоксигенного клона в токсигенный in vivo.

Таким образом, важным итогом проведенных исследований является получение новых данных о популяционной гетерогенности V. cholerae. В пределах популяции обнаружено два морфологически разных варианта, отличающихся друг от друга экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции, что расширяет имеющиеся представления о диапазоне изменчивости возбудителя холеры. Учитывая процесс координированного переключения активности генов, можно сделать предположение, что у V. cholerae О1 серогруппы существует еще неизвестный регуляторный механизм, который контролирует дифференциальную экспрессию соответствующих генов, который может лежать в основе формирования клонов с новым патогенным потенциалом.

4. Фенотипический и молекулярно-генетический анализ генетически модифицированных штаммов V. cholerae классического биовара с измененной продукцией факторов патогенности.

В 1999 г. были получены данные о том, что мутации в промоторе структурных генов tcpA-F, контролирующих биосинтез пилей ТCP, изменяют активность регуляторного гена toxT, что приводит почти к 10-кратному понижению уровня продукции СТ (Yu, DiRita, 1999). Выявленный новый механизм координированного изменения экспрессии ключевых генов патогенности и иммуногенности послужил основанием для предположения о том, что при повышении продукции СТ за счет введения в клетки холерного вибриона в составе рекомбинантной плазмиды дополнительных копий структурных генов ctxAB и гена антирепрессора rstC может произойти увеличение биосинтеза ТСР и других факторов вирулентности.

В качестве модельных было отобрано две группы штаммов – с высокой (V. cholerae 569В, Дакка 35, КМ200) и умеренной продукцией СТ (V. cholerae М-9, В-1307, J-89) (таблица 3).

Таблица 3 - Продукция факторов патогенности природными и сконструированными штаммами V. сholerae классического биовара.

Штамм V. cholerae СТ (по данным GM1 ELISA), мкг/мл ТСР** Белки внешней мембраны

OmpU OmpT

Дакка 35 13,0±1,0 - следы +

2414* [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 42,0±2,5 ++++ + следы

КМ206 (бесплазмидный производный 2414) KmsTcs Тох++ТСР++ 40,0±0,2 ++++ + следы

569В 9,0±1,8 + следы +

2415 [569В (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 38,4±1,6 ++++ + -

КМ207 (бесплазмидный производный 2415) KmsTcs Тох++ТСР++ 34,0±0,2 ++++ + -

КM200 14,0±1,6 +++ + +


загрузка...