Штаммы Vibrio cholera с измененной экспрессией генов вирулентности (06.07.2009)

Автор: Заднова Светлана Петровна

ЗАДНОВА Светлана Петровна

ШТАММЫ VIBRIO CHOLERAE С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ

03.00.07 - микробиология

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

САРАТОВ - 2009

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

Член-корреспондент Российской Академии

медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Доктор медицинских наук, профессор Замараев Валерий Семенович

Доктор биологических наук, профессор Тараненко Татьяна Михайловна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН»

Защита состоится «_____» ______________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005,

г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «____»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространение холеры в странах Азии, Африки и Латинской Америки свидетельствует о том, что эта инфекция по-прежнему остается угрозой для многих стран, включая и Российскую Федерацию (Онищенко с соавт., 2005; Кутырев, 2008; Ломов с соавт., 2008). Важным и перспективным направлением в решении проблемы холеры является изучение генетических основ изменчивости вирулентных свойств возбудителя. О большой вариабельности генома этого патогена свидетельствует тот факт, что в процессе эволюции сформировано три эпидемически опасных варианта Vibrio cholerae: О1 серогруппы классического биовара, О1 серогруппы эльтор биовара и О139 серогруппы (Бароян, 1971; Ломов, 2004; Смирнова, Кутырев, 2004; Finkelstein, 1973; Kaper et al., 1995; Matson et al., 2007).

Очевидная необходимость проведения исследований по проблеме изменчивости V. cholerae определяется и тем, что в связи с изменяющимися экологическими условиями постоянно растет частота выделения природных атипичных штаммов возбудителя холеры. Особый интерес вызывает процесс образования природных штаммов с повышенной вирулентностью (Смирнова с соавт., 2008; Albert et al., 1993; Sharma et al., 1997; Davis et al., 1999; Nair et al., 2002, 2006; Faruque et al., 2003, 2007; Safa et al., 2005, 2008; Raychoudhuri et al., 2009). Структурно-функциональный анализ таких изолятов может обеспечить получение фундаментальных знаний о новых механизмах формирования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Более того, на их основе возможен поиск новых способов генодиагностики природных штаммов с измененной вирулентностью для осуществления адекватного мониторинга внешней среды с целью прогнозирования эпидемических ситуаций.

Поскольку возбудитель холеры может существовать как в инфицированном макроорганизме (человек), так и в природных экосистемах, то другая важная проблема состоит в изучении взаимосвязи между синтезом факторов вирулентности и персистенции V. cholerae, так как этот вопрос остается малоизученным. Так, в последние годы интенсивно изучается механизм обратимых фазовых вариаций, которые выражаются в переключении биосинтеза экзополисахарида или EPS (от англ. – exopolysaccharide), обеспечивающего выживаемость клеток во внешней среде в составе биопленки (Yildiz et al., 2001; Ali et al., 2002). При этом у клонов, продуцирующих экзополисахарид, снижается уровень биосинтеза ряда факторов патогенности (Yildiz et al., 2004). Вместе с тем единичные сообщения на эту тему не дают полного представления об изменении экспрессии генов вирулентности при адаптации возбудителя холеры к меняющимся условиям окружающей среды. Отсутствуют данные о сигналах внешней среды, приводящие к репрессии факторов патогенности при росте клеток в неблагоприятных условиях. Остается неясным, при каких условиях окружающей среды осуществляется переключение экспрессии генов патогенности V. cholerae, определяющее появление у возбудителя вирулентных свойств. Между тем выявление факторов внешней среды, обеспечивающих индукцию экспрессии факторов вирулентности в природных популяциях, может внести существенный вклад в повышение эффективности мониторинга внешней среды.

Еще одной не менее важной является проблема экспрессии резидентных генов патогенности в бактериальных клетках, получивших дополнительный генетический материал (различные плазмиды, транспозоны, бактериофаги). До недавнего времени считалось, что рекомбинантные плазмиды с клонированными генами различных факторов патогенности при введении их в клетки реципиентных штаммов определяют повышенный уровень продукции белков, биосинтез которых кодируется этим дополнительным генетическим материалом. Проведение интенсивных исследований в этом направлении привело к созданию штаммов-продуцентов холерного токсина и его В-субъединицы (Янишевский, 1986; Ильина с соавт., 1987; Филькова с соавт., 1988; Смирнова, 1989; Чеховская, Смирнова, 1994; Захарова, 1997; Ерошенко, 2004; Faruque et al., 2000). В тоже время сведения об изменении экспрессии хромосомных генов, определяющих продукцию других факторов патогенности в клетках, содержащих плазмидный геном, практически отсутствуют. Геномный и протеомный анализ таких штаммов будет основой для понимания ранее неизвестных путей регуляции экспрессии важнейших генов патогенности в новом генетическом окружении. Полученные фундаментальные знания открывают новые подходы для создания штаммов с повышенной продукцией одновременно нескольких протективных антигенов. Такие штаммы могут быть использованы для изготовления современных диагностических и профилактических препаратов.

Цель работы – молекулярно-генетический и биохимический анализ природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности и создание на их основе штаммов-продуцентов основных протективных антигенов.

Задачи исследования:

Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров для выявления фенотипических вариантов с координировано измененным уровнем продукции факторов патогенности и персистенции. Создать коллекцию изогенных штаммов с разным уровнем экспрессии ключевых генов вирулентности.

Провести сравнительный анализ фено- и генотипических свойств двух типов изогенных вариантов природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, различающихся по продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар) и подвижности (Mot). Выделить, очисть и изучить моносахаридный состав экзополисахарида модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара.

Провести сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов (EPS++Тох+Нар++Mot++ и EPS+Тох++Нар+Mot+) модельного штамма V. cholerae Дакка 35. Выяснить роль отдельных белков и экзополисахарида в адаптации клеток к неблагоприятным условиям окружающей среды.

Выявить факторы внешней среды, вызывающие координированное переключение экспрессии различных генов вирулентности и персистенции в клетках V. cholerae классического биовара.

Изучить влияние рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 на экспрессию хромосомных генов V. cholerae классического биовара, включая ключевые гены вирулентности и иммуногенности.


загрузка...