Морфо-физиологические аспекты гуморальных и клеточных механизмов неспецифической резистентности организма (06.07.2009)

Автор: Плескова Светлана Николаевна

Таблица 9

Значения модуля Юнга, изменяющиеся в ходе инкубации нейтрофилов

с ЛПС P. mirabilis 210 (10 мкг/мл)

инкубации Конт

роль 15 мин 30 мин 40 мин 60 мин 70 мин 90 мин 110 мин 120 мин 150 мин

Модуль Юнга, кПа 2,1(0,7 8,2

2,9* 18,0

4,5* 5,7

1,7* 4,4

1,9 17,5

7,9* 8,9

1,1* 2,9

0,5 23,7

1,2* 4,5

* - различия с контролем статистически значимы (р<0,05)

На всем протяжении эксперимента значения ригидности ни разу не опускались ниже уровня контроля, а, напротив, поддерживались на достаточно высоком уровне, что является косвенным доказательством реализации клеткой апоптотической программы (Elmore, 2007). Для сравнения аналогичная серия экспериментов была проделана с ЛПС E.coli O127:B8. Морфология нейтрофильного гранулоцита постоянно изменялась, но общая направленность изменений соответствовала тем, что отмечались при внесении ЛПС P. mirabilis 210, хотя первоначальное набухание клеток было не столь выраженным. Фрагментация ядра клетки отмечалась через 90 мин после внесения ЛПС. Аналогичные с действием ЛПС штамма P. mirabilis 210 колебания упругости мембраны нейтрофильного гранулоцита отмечены и как результат реакции на ЛПС E.coli O127:B8. Показатели ригидности не разу не снижались ниже контрольного уровня.

Таким образом, несмотря на разнонаправленность влияния на респираторную активность нейтрофильных гранулоцитов (ЛПС P. mirabilis 210 ингибировал, а ЛПС E.coli O127:B8 не изменял этого параметра) ЛПС разных штаммов вызывают сходные изменения морфологии клеток и свойств мембран. Отделение от клеток «апоптозоподобных» телец и значительное увеличение ригидности клеточных мембран заставляют предположить, что в данном случае наблюдается апоптоз нейтрофильных гранулоцитов. Против этого предположения выступает только факт первоначального (на первых минутах наблюдения) увеличения объема клеток после внесения ЛПС. Однако анализ литературных данных показывает, что дегидратационное сокращение объема клеток отнюдь не является облигатным признаком апоптоза. В частности, в работе А.А. Веренинова и др. (2004) показано, что сочетание определенных индукторов и типов клеток приводит к апоптозу без дегидратационного уменьшения объема клеток, тогда как остальные признаки апоптоза (конденсация и фрагментация хроматина, образование апоптозных телец, выпадение из популяции S-фазных клеток) сохраняются. По литературным данным ЛПС является антиапоптотическим агентом. Однако видимого противоречия удается избежать, если, во-первых, учитывать, что в случае проведения СЗМ экспериментов нейтрофильные гранулоциты адгезируются на поверхности подложки, а такая реакция сама по себе обладает кондиционирующим эффектом. В литературных источниках приводятся данные об инкубации нейтрофилов с ЛПС в пробирках, что исключает адгезию клеток. Можно предположить, что первоначальная активация клетки приводит к изменению реакции на ЛПС. Во-вторых, нельзя сбрасывать со счетов и воздействие зонда на механорецепторы нейтрофилов, которое хотя и не вызывает изменения морфологии клеток, но может трансформировать реакцию клеток на тот или иной (в том числе биохимический) стимул.

ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В СИСТЕМАХ С ПЕРОКСИДОМ ВОДОРОДА

При исследовании воздействия пероксида водорода на нейтрофилы было показано, что метод СЗМ имеет ограничения, поскольку при добавлении пероксида в концентрации более 25 мкМ с высокой интенсивностью идет реакция по разложению перекиси до Н2О и О2. При этом активно выделяющиеся пузыри кислорода укрупняются и оседают на зонде. Это препятствует сканированию, так как изменяется амплитуда колебаний зонда.

Наблюдение за нейтрофильными гранулоцитами в течение 120 минут при внесении Н2О2 в концентрациях от 3 мкМ до 25 мкМ, показало, что возможно два варианта изменения клеточной морфологии. В первом случае клетка размягчается и сдирается зондом с поверхности подложки. В данном случае речь идет о некротической гибели клеток (рис. 9).

Во втором случае клетки «мумифицировались» и практически не изменяли своих параметров в ответ на сканирование, что вероятнее всего также обусловлено гибелью клеток (рис. 10).

Этот вариант гибели клеток не встречался еще не в одной серии экспериментов. Его уникальность заключается в чрезвычайной жесткости мембраны клетки. О том, что мембрана видоизменяется настолько, что морфология клетки становиться неизменной свидетельствует и тот факт, что усиление механического давления на клетку со стороны зонда никак не влияет на изменение её параметров. Постоянное увеличение силы давления проводилось с 2,2 nN до 16,2 nN и в конечном итоге составило значительную силу, в 6,5 раз превышающую оптимальную силу надавливания на интактные клетки в процессе сканирования.

Рис. 9. Некротическая гибель клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ)

Рис. 10. «Мумификация» клеток после внесения пероксида водорода в концентрации 3,1 мкМ (изображения получены в физиологическом растворе в режиме реального времени методом АСМ).

Поскольку исследование взаимодействия нейтрофилов с Н2О2 методом СЗМ имеет ограничения, то для изучения её влияния в больших концентрациях клетки инкубировали с Н2О2 разной концентрации и делали фиксированные мазки по Романовскому-Гимзе. В данном случае обнаруживалась гибель ПМЯЛ по двум классическим путям: некрозу и апоптозу. Некроз-апоптотическое соотношение было подсчитано в серии независимых экспериментов с окрашиванием клеток. Суммарные значения приведены в таблице 10. В результате зафиксировали значительное увеличение некротической гибели клеток, в то время как апоптоз нейтрофилов сохранялся приблизительно на одном уровне при разных концентрациях Н2О2 и не превышал уровня 15,9±5,0 %.

Таким образом, главным результатом в ходе исследования влияния на нейтрофилы пероксида водорода методом СЗМ является выявление нетипичной для нативных, а также некротически и апоптотически гибнущих клеток структурной перестройки мембран, характеризующейся крайне высокой жесткостью.

Таблица 10

Некроз-апоптотические соотношения гибели нейтрофильных гранулоцитов при внесении разной концентрации Н2О2

Концентрация

Н2О2 контроль 50 мкМ 100 мкМ 150 мкМ 200 мкМ 250 мкМ

Интактные клетки (%) 94,7±

0,6 79,3±

0,6 69,3±

3,8 68,7±

2,1 35,0±

11,3 23,0±

Апоптоз (%) 2,3±0,6 11,7±1,5 22,0±1 17,3±5,5 18,5±3,5 10,0±8,5

Некроз (%) 3,0±1,0 9,0±1,0 8,7±3,1 18,3±1,5 46,5±14,9 67,0±9,9

ДИНАМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В СИСТЕМАХ С КВАНТОВЫМИ ТОЧКАМИ

Поскольку при всех вариантах поступления наночастиц в организм человека они неизбежно оказываются в крови, то изучение реакции клеток крови на наноматериалы является первоочередной задачей. Для исследования влияния квантовых точек на жизнеспособность нейтрофильных гранулоцитов первоначально оценивалась жизнеспособность интактных клеток. Для этого в течение 10 часов нейтрофилы, изолированные из кровяного русла и находящиеся в ЗФР в концентрации 500 тыс. кл/мл в термостатируемой ячейке конфокального микроскопа, наблюдали в режиме реального времени. За все время наблюдения клетки демонстрировали высокую степень активности: быстрое передвижение гранул в цитоплазме, миграционная активность, образование псевдоподий. Тест с трипановым синим показал значение жизнеспособности нейтрофилов – 99% как в начале наблюдения за клетками, так и по окончании процесса.


загрузка...