Морфо-физиологические аспекты гуморальных и клеточных механизмов неспецифической резистентности организма (06.07.2009)

Автор: Плескова Светлана Николаевна

Представленный результат был подтвержден исследованием морфологии бактериальных клеток методом СЗМ: клетки штаммов P. vulgaris 296 и P. mirabilis 120 набухали и лизировались, а бактерии штаммов P. vulgaris 856 и P. mirabilis 210 сохраняли целостность, но при этом окружались компонентами сыворотки – предположительно белками-опсонинами.

Таким образом, независимые эксперименты по подсчету КОЕ, изучению стимуляции нейтрофилов в ЛЗХЛ и исследованию морфологии бактериальных клеток доказывают реализацию двух стратегий АПАК в отношении грамотрицательных бактерий рода Proteus: лизиса или опсонизации. При этом суммарное расходование С3b компонента комплемента при реализации любого из механизмов в течение 60 мин одинаково.

Различия в активации АПАК у протея обусловлены, прежде всего, особенностями строения клеточной стенки, поэтому исследовали АПАК-реактивность ЛПС, выделенного из 4 изучаемых штаммов. ЛПС тестировался в реакции С3b-зависимой адгезии нейтрофилов на гранулах сефадекса. Способность активировать комплемент при инкубации в сыворотке практически не отличается у ЛПС трех из четырех изучаемых штаммов и является достаточно низкой: P. vulgaris 296 – 28,7±7,2%; P. vulgaris 856 – 26,2±3,4%; P. mirabilis 120 – 41,5±1,5%, в то время как у ЛПС P. mirabilis 210 способность активировать АПАК была высокой и достигала уровня цельной бактериальной клетки: 80,0±0,9%.

В реакции ЛЗХЛ нейтрофилов стимуляцию клеток проводили ЛПС четырех видов бактерий рода Proteus. Вначале изучалась респираторная активность нейтрофильных гранулоцитов в реакциях с экстрагированным ЛПС, а затем с ЛПС предварительно проинкубированным в системе АПАК. В качестве позитивного контроля жизнеспособности клеток выступал зимозан. Данные экспериментов суммированы в таблице 6.

Таблица 6

Хемилюминесцентная активность нейтрофилов, стимулированная липополисахаридом (ЛПС) штаммов протея

Стимулятор люминесценции Индекс стимуляции

Максимум люминесценции (I мах) Суммарная светосумма

Зимозан 166,31 ± 26,5 79,21 ± 1,94

ЛПС P. mirabilis 120 3,22 ± 0,62* 2,67 ± 0,51*

ЛПС P. mirabilis 210 1,05 ± 0,08* 1,06 ± 0,03*

ЛПС P. vulgaris 296 10,06 ± 0,83* 5,88 ± 0,05*

ЛПС P. vulgaris 856 3,99 ± 0,24* 2,92 ± 0,32*

ЛПС P. mirabilis 120 + АПАК 1,05 ± 0,06* 0,82 ± 0,13*

ЛПС P. mirabilis 210 + АПАК 1,31 ± 0,01* 0,65 ± 0,04*

ЛПС P. vulgaris 296 + АПАК 5,62 ± 0,59* 5,18 ± 0,21*

ЛПС P. vulgaris 856 + АПАК 1,84 ± 0,57* 1,22 ± 0,26*

* достоверность различий активности хемилюминесценции нейтрофилов после стимуляции их ЛПС штаммов до и после инкубации в сыворотке (р<0,05).

Представленные результаты показывают, что ЛПС разных штаммов обладает разной активностью в отношении респираторного взрыва нейтрофилов. Наибольшей она была у P. vulgaris 296. Однако в остальных случаях ЛПС протея слабо активировал респираторный взрыв, а ЛПС P. mirabilis 210 вообще не вызывал стимуляции нейтрофилов (образование АФК соответствовало уровню спонтанной хемилюминесценции). Наиболее интересным результатом исследования явились показатели активирующей способности ЛПС штаммов протея, после 60 мин инкубации в системе с избирательной активацией АПАК. После такой инкубации только ЛПС одного штамма P. vulgaris 296 сохранял высокий активирующий потенциал (хотя и в этом случае он снижался по сравнению с интактным ЛПС), тогда как у всех остальных штаммов достоверно снижалась активирующая способность.

Полученные данные интересно сравнить с работой А.Е. Платонова и др. (1999), где изучалось повреждение гранулоцитов человека под действием менингококкового липополисахарида. В этой работе показано, что повреждение и гибель гранулоцитов под влиянием ЛПС происходит только при условии наличия в системе интактного комплемента и не зависит от концентрации ЛПС и наличия антител к нему. Полученные нами результаты подтверждают данные исследования, поскольку после инкубации ЛПС с белками альтернативного каскада комплемента нейтрофилы теряли способность активироваться.

Особое внимание обратили на ЛПС штамма P. vulgaris 296, который не подавлял, а стимулировал кислородный взрыв нейтрофилов. В остальных трех случаях клетки поддерживали слабую респираторную активность на фоновом уровне. Имеются работы, подтверждающие возможность апоптоза нейтрофилов под влиянием связывания рецептора их мембран (CD14) с ЛПС (Van Oostveldt et al., 2002). Однако такое связывание не опосредовано белками комплемента, и, по-видимому, реализуется напрямую. В настоящее время вопрос о том, как координируется действие сывороточных белков, влияющих на связывание ЛПС с клеточными мембранами и сывороточных белков, опосредующих сигнальные функции ЛПС, остается не изученным.

Пока с уверенностью можно сказать только, что межштаммовые различия протея в системе АПАК обусловлены не только различиями в строении клеточной стенки бактерий, поскольку активаторная способность главного компонента клеточных стенок – ЛПС не соответствует реакциям с цельными бактериальными клетками.

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ В АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ

Изменение морфологических параметров клеток проецируют на их физиологические свойства, что наряду с функциональной характеристикой дает полноценную информацию об участии в поддержании гомеостаза. На следующем этапе исследований проводили анализ сканированных образцов фиксированных и витальных нейтрофильных гранулоцитов методом СЗМ. Результаты сканирования отражают полиморфизм нейтрофилов. На препаратах, где происходит не только адгезия, но и распластывание нейтрофилов определяются границы клеток, полиморфное ядро, видны гранулы цитоплазмы. Особенно хорошо эти структуры выявляются на боковом сечении профиля клетки. Однако при исследовании живых препаратов наблюдали также нейтрофилы, плохо распластывающиеся на субстрате, где границы клетки выражены достаточно четко, но ядро определялось плохо и могло быть выявлено только по боковому сечению профиля клетки. Поскольку практически вся цитоплазма оказывается сконцентрированной возле ядра, гранулы цитоплазмы практически не идентифицируются. В случае фиксации метанолом границы клеток выражены отчетливо, всегда определяется сегментированное ядро и гранулы. Однако фиксированная клетка практически лишается воды, полностью распластывается по поверхности подложки (от чего становится четко выраженной топография ее внутренней структуры) и это резко изменяет морфологические параметры клетки (табл. 7).

Таблица 7

Морфологические параметры нейтрофильных гранулоцитов, измеренные методом СЗМ при использовании фиксации и без нее

Нативные клетки (живые НГ) Клетки, фиксированные метанолом Клетки, фиксированные глутаровым альдегидом

Диаметр клеток (мкм) 14,55 ± 0,55* 16,72 ± 0,41* 18,25 ± 0,48*

Высота клеток (мкм) 2,13 ± 0,11** 0,66 ± 0,03** 1,03 ± 0,05**

* F = 15,11 ((вну = 138,1; (меж = 9,136) * р(0,001 – различия между группами статистически значимы; **F = 99,26 ((вну = 214,1; (меж = 2,15) * р(0,001 - различия между группами статистически значимы.

Большим преимуществом в исследовании фиксированных препаратов является то, что разрешение сканирующего зондового микроскопа в воздушной среде оказывается выше. При получении изображения методом СЗМ общепризнанным методом фиксации является обработка глютаровым альдегидом (Dufrene, 2001). Однако мы не обнаружили преимуществ данного метода фиксации: поскольку при такой обработке клетка сохраняет воду и не распластывается по подложке ее изображение идентично изображению нативных нейтрофильных гранулоцитов, где четко определены границы клеток, однако ядро и гранулы не выявляются. Заметна только шероховатость мембраны, которая практически не выявляется при фиксации метанолом. Однако размеры нейтрофильных гранулоцитов при фиксации глютаровым альдегидом отличаются от нативных препаратов.

Любой метод фиксации искажает размеры клеток: при фиксации метанолом это по большей части отражается на высоте клетки, при фиксации глютаровым альдегидом на поперечных размерах клетки (табл. 7). В целом можно отметить, что хотя использование фиксированных препаратов имеет целый ряд преимуществ перед нативными пробами, морфологические параметры при исследовании фиксированных препаратов оказываются искаженными. Поэтому для изучения процессов, протекающих в клетке и морфологических изменений, сопровождающих эти процессы удобнее использовать исследования нефиксированных препаратов в жидкой фазе, а для визуализации детальных подробностей этих изменений лучше использовать методы фиксации, среди которых предпочтение нужно отдавать фиксации метанолом.

Метод АСМ не ограничивается наблюдением морфологии интактной клетки. Например, реализация такой эффекторной функции как фагоцитоз сопровождается у нейтрофила образованием псевдоподий, а их можно четко визуализировать. На рис. 3 представлено, как меняется морфология нейтрофильного гранулоцита при внесении в среду инкубации бактерий, опсонизированных в системе АПАК.

Рис. 3 Изменение морфологии нейтрофилов при инкубации с бактериальными клетками (фиксация метанолом):

(а) морфология интактной клетки,

(б) морфология нейтрофила через 5 минут, после инкубации с опсонизированным в системе АПАК S. аureus 7 М

Параллельно этому эксперименту проводились опыты по исследованию ЛЗХЛ, где к суспендированным нейтрофилам добавляли опсонизированные S.aureus 7M, показатели хемилюминесценции снимали каждые 5 мин (рис. 4).

Морфологические наблюдения показывают, что наиболее интенсивно псевдоподии формируются у нейтрофильных гранулоцитов на 5 – 10 мин наблюдения, тогда как пик респираторной активности достигается только на 25 – 40 мин. Оба процесса: и формирование активных форм кислорода и образование псевдоподий зависят от АТФ. Скорее всего, в течение респираторного взрыва энергетические ресурсы нейтрофила интенсивно перераспределяются в сторону гексозомонофосфатного шунта (для продукции свободных радикалов кислорода), а не в сторону гликолиза (для продукции АТФ, необходимой для активной сборки цитоскелета).

Рис. 4 Кинетика респираторного взрыва нейтрофильных гранулоцитов после стимуляции опсонизированным S.aureus 7М

Поэтому вероятно, что увеличение продукции активных форм кислорода это фактор, который может ограничивать способность ПМЯЛ формировать псевдоподии in vitro, поскольку на этом этапе внутриклеточного метаболизма энергетические ресурсы клетки перераспределены на более эффективное внутриклеточное разрушение микроорганизма. В результате исследований показано, что две стадии фагоцитоза: формирование псевдоподий, захват чужеродных тел, втягивание внутрь мембраны и формирование активных форм кислорода – процессы не связанные между собой. Можно сказать, что приведенное исследование доказывает описанный ранее (Маянский, 1989) феномен функциональной дискретности нейтрофилов.


загрузка...