Роль полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена р53 в патогенезе онкологических заболеваний (06.07.2009)

Автор: Дмитриева Алла Ивановна

Анализ доли гомозигот по нулевому аллелю глутатион-S-трансферазы Т1 показал достоверную связь делеционной формы этого гена и риска развития рака легкого (OR=4,26), что согласуется с данными современной литературы, которые также постулируют увеличение относительного риска рака легкого, связанного с GSTT10/0 [Spitz M.R. et al., 2000, Hou S.M. et al., 2001, Sorensen M. et al.,2004]. Для рака предстательной железы было выявлено двукратное увеличение частоты нулевого генотипа GSTT1 по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц. Риск развития рака предстательной железы у носителей нулевого генотипа GSTT1 составил 2,98 (рис. 7).

В распределении вариантных генотипов гена GSTT1 были получены достоверные различия между больными раком легкого и раком предстательной железы по сравнению со здоровыми лицами.

Из генов семейства глутатион-S-трансфераз полиморфизм GSTP1 наименее представлен в публикациях по раку легкого. Аллельные варианты данного гена (GSTP1/del105 – А/Г и del105/del105 – Г/Г), кодирующие синтез белка со сниженной ферментативной активностью, нами были объединены в одну группу показателей. При этом частота делеционного аллеля гена GSTP1 (29,8%) почти в 2 раза превышала таковую у здоровых доноров (15,4%), а относительный риск развития рака легкого составил 2,34 (CI95% 1,68-3,25). Для рака желудка и кишечника также была установлена статистически более высокая частота функционально неполноценного аллеля по сравнению со здоровыми лицами (26,7 и 31,8%, соответственно при р=0,000). Наибольшая частота делеционного аллеля данного гена регистрировалась в выборке больных раком предстательной железы (41%), при этом риск развития данного заболевания составил 5,10 (CI95% 3,14-8,31) (рис. 8).

Рис. 8. Показатели относительного риска (OR) развития злокачественных новообразований (рака легкого – РЛ, рака желудка – РЖ, рака толстой кишки – РТК, рака предстательной железы – РПЖ) для носителей нулевых генотипов GSTР1 при р<0,05.

Противоречивость данных литературы о влиянии глутатион-S-трансфераз на формирование онкологического риска при различных онкологических заболеваниях побудило нас исследовать различные по механизмам развития онкопатологии (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки и рак предстательной железы) и сделать заключение о специфичности участия этих ферментов в канцерогенезе.

С клинической и особенно прогностической точки зрения метастазирование представляет собой важнейший этап в патогенезе злокачественных опухолей. Это свойство злокачественного онкологического процесса в значительной степени зависит от свойств первичной опухоли, а также от неоангиогенеза и подвижности опухолевых клеток [Engers R., Gabbert H.E., 2000; Meyer T., Hart I.R., 1998; Георгиев Г.П., 2000; Заридзе Д.Г., 2000; Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000; Аничков Н.М., 2003; Давыдов М.И., 2008; Чиссов В.И. и соавт., 2009].

В настоящем исследовании установлено, что нулевые генотипы GSTT1, GSTM1 и патологические аллели GSTP1 играют важную роль в прогрессии злокачественных новообразований, поскольку нами была обнаружено достоверное увеличение доли делеционных вариантов GSTT1 и тенденция к преобладанию нулевых вариантов гена GSTM1 у больных раком легкого с метастазами (рис. 9).

Рис. 9. Частота функционально неполноценных генотипов GSTT1, GSTM1, GSTP1 у больных раком легкого, раком желудка, раком толстой кишки в зависимости от наличия очагов метастазирования.

Наличие метастатических очагов у больных раком желудка ассоциировано с более высокой частотой нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1. Поскольку в доступной литературе мы не нашли данных по распределению генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в зависимости от клинических особенностей опухолевого процесса, таких как стадия онкологического заболевания, распространенность опухолевого узла, наличие очагов метастазирования, прогрессирование заболевания, влекущее вслед за собой неблагоприятный исход, можно предположить, что нулевые генотипы GSTT1 и GSTМ1, кодирующие функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков – глутатион-S-трансферазы Т1 и М1, способствуют более длительному сохранению в организме активных промежуточных метаболитов, обладающих мутагенными и канцерогенными свойствами, которые могут не только провоцировать возникновение злокачественной опухоли, но и способствовать её метастазированию и прогрессированию заболевания. Метастазирование злокачественных новообразований является динамическим, многоэтапным, каскадным процессом. Для образования метастатического очага необходимо разъединение, обособление малигнизированных клеток с полной утратой межклеточных кадхерин-катениновых контактов и выход их из озлокачествленного паренхиматозного комплекса в первичном опухолевом узле [Engers R., Gabbert H.E., 2000; Георгиев Г.П., 2000; Аничков Н.М., 2003; Галицкий В.А., 2003; Луценко С.В. и соавт., 2003;Давыдов М.И., 2008; Коничев А.С. и соавт., 2008].

Можно обсуждать следующую гипотезу возникновения метастазов на фоне высокой частоты функционально неполноценных генотипов GSTT1, GSTМ1 и GSTP1: дефект ферментов биотрансформации ксенобиотиков (в частности, глутатион-S-трансфераз) приводит к повышенной восприимчивости клеток к повреждающим воздействиям окружающей среды, что способствует накоплению мутагенных и/или канцерогенных веществ, вызывающих мутации 1) в генах, кодирующих соединения, участвующие в образовании плотных межклеточных контактов. Вследствие этого происходит ослабление сил сцепления между клетками и последующий их отрыв друг от друга; в конечном итоге образуется метастатический очаг, 2) в генах, ответственных за ангиогенез, являющийся необходимой составляющей метастазирования опухолей.

Таким образом, блокирование работы ферментов второй фазы биотрансформации приводит к снижению дифференцировки опухоли и повышению ее пролиферативной активности, а также повышает способность трансформированных клеток к метастазированию, что определяет прогрессию опухолевого процесса.

Изучая особенности распределения вариантных генотипов GSTT1, GSTM1 и GSTP1 у больных раком предстательной железы в зависимости от стадии заболевания, мы обнаружили, что доля патологических вариантов гена GSTT1, GSTM1 и GSTP1 увеличивается, начиная со второй стадии, при этом достигает статистически значимых различий на III и IV стадиях развития опухоли. C. Jeronimo et al. (2001) утверждают, что потеря функции глутатион-S-трансфераз играет критическую роль на ранних этапах онкогенеза простаты. Такие выводы были сделаны на основании иммуногистохимического исследования ткани предстательной железы у больных раком простаты и с преднеопластическими изменениями в предстательной железе. Было обнаружено, что экспрессия ферментов резко снижена в опухолевой ткани и в метапластически измененных образцах, причем такие изменения коснулись не только ткани, в которой ген GSTP1 был инактивирован метилированием. Тем не менее, C. Ntais et al. (2005) на основании анализа литературы подвергли сомнению наличие высокого риска развития рака предстательной железы при наличии делеционных вариантов генов GST и выдвинули предположение, что GST выступают предрасполагающими факторами к раку вообще. Следует отметить, что в качестве кандидатных на содержание аутосомно-доминантного гена наследственного рака простаты были предложены, по крайней мере, семь регионов генома, включая 1q24-1q25 (HPC1), 1q42-q43 (PCAP), Xq27-q28 (HPCX), 1p36 (CAPB), 20q13 (HPC20), 17p11 (ELAC2) и 16q23 [Nwosu V. et al., 2001; Bratt O., 2002; Simard J. et al., 2002]. Ни один из данных регионов не был последовательно идентифицирован в различных популяциях, и ни один из данных генов не был столь же специфичным для рака предстательной железы, как, например, делеция в районе 5q21 при колоректальном раке. Это дает основание считать, что генетическое предрасположение к раку простаты не может следовать стандартной схеме. Вместо мутаций в определенных генах, приводящая к высокому риску генетическая восприимчивость к раку простаты может зависеть от распространенных полиморфизмов, умеренно увеличивая риск болезни у гетерозигот или гомозигот. Полиморфизмы в генах, связанных с рецепторами и метаболизмом гормонов, защитой клетки, репарацией ДНК и метаболизмом нуклеотидов могут быть вовлечены в канцерогенез.

?????????•?

??????i

??????i

??????i

??????i

??????i

??????i

??????i

??????i

TВ раковых образованиях, вызванных химическими канцерогенными веществами, полиморфизмы генов метаболизма ксенобиотиков могут существенно смоделировать риск развития рака простаты. Среди них особое место занимают глутатион-S-трансферазы, которые защищают против потенциально мутагенных эндогенных и экзогенных соединений. Действительно, полиморфизмы в GSTT1 и GSTP1 как связанные с увеличением риска развития рака простаты, были описаны в работах С. Steinhoff et al. (2000), А. Gsur et al (2001), Z. Kote-Jarai et al. (2001).

Представляется очевидным, что в развитии онкопатологии имеет значение баланс активностей различных глутатион-S-трансфераз, поскольку они имеют перекрывающуюся субстратную специфичность, и некоторые из них полиморфны [Raunio H., Pelkonen O., 1995; Ляхович В.В. и соавт., 1997; Reszka E., Wasowicz W., 2001]. В связи с этим риск онкопатологии, связанный с нулевыми генотипами GSTT1 и GSTM1, может снижаться за счет активности других GST. Возможный механизм опухолевой трансформации клеток на фоне высокого уровня нулевых генотипов GSTT1 и GSTM1 состоит в следующем: функционально неполноценные ферменты второй фазы биотрансформации ксенобиотиков – глутатион-S-трансферазы ?1 и ?1 способствуют накоплению большого количества активированных канцерогенов. В результате этого образуются ДНК-аддукты, которые вызывают повреждения ДНК, не подвергающиеся репарации [Ryberg D. et al., 1997; Butkiewiez D. et al., 2000; Miller D.P. et al., 2002]. Было показано [To-Figueras J. et al., 1996; Lloid D.R. et al., 2000; Wani M.A. et al., 2000; Hussain S.P. et al., 2004], что в клетках, поврежденных эпоксидами диола бензпирена, возникает мутация в гене р53. За счет снижения белковой функции исчезает способность гена р53 останавливать клеточный цикл для свершения репарационных процессов [Lloid D.R. et al., 2000; Wani M.A. et al., 2000; Liu G. et al., 2001; Киселев Ф.Л. и соавт., 2005; Копнин Б.П., 2006; Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н., 2007], что в дальнейшем приводит к повреждению клетки и канцерогенезу.

С целью изучения механизмов участия полиморфных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена-онкосупрессора р53 в канцерогенезе в настоящем исследовании была предпринята попытка оценить частоту распределения вариантных генотипов ФБК у всех обследованных нами онкологических больных (рак легкого, рак желудка, рак толстой кишки, рак предстательной железы) в зависимости от статуса р53.

На первом этапе изучения полиморфизма гена р53 у онкологических больных было установлено значимое увеличение частоты про-аллеля в группах больных раком предстательной железы (на 43,1%) и раком желудка (на 63,5%) по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (25,5%) (табл. 3). При раке легкого и раке толстой кишки также отмечалось увеличение частоты вариантного генотипа р53 (хотя и статистически не значимое), что указывает на важную роль этого фактора в развитии злокачественных новообразований.

В исследовании полиморфизма 72-го кодона р53 в опухолевых клетках больных раком желудка Новосибирской области, проведенном В.А.Белявской и соавт. (2006), была выявлена статистически более высокая частота про-аллеля у больных раком желудка по сравнению со здоровыми донорами. Несмотря на известный факт, что про-аллель более эффективно индуцирует FasL/Fas-опосредованный апоптоз опухолевых клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, позитивная роль про-аллеля не проявлялась при нарушении передачи апоптотического сигнала в опухолевой клетке вследствие мутаций в гене р53. В этом случае клетка не только не подвергается апоптозу, но способна «переадресовать» индукцию апоптотического сигнала на контактирующий с ней цитотоксический Т-лимфоцит, приводя его к гибели [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Выявленная нами «рисковая значимость» про-гомозиготности (аллеля) в комбинации с соматическим мутагенезом р53 может свидетельствовать о том, что рак желудка у носителей про-аллеля развивается именно по такому сценарию. Предполагается, что согласованное функционирование обоих аллелотипов р53 обеспечивает более эффективную защиту от комбинированного влияния трансформирующих сигналов, воздействующих на эпителий слизистой желудка [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Для более полного понимания роли генетического статуса в процессе возникновения и прогрессии злокачественных новообразований необходимы дальнейшие исследования с учетом анализа генетической идентичности ДНК, выделенных из нормальных и опухолевых клеток одного и того же пациента.

На втором этапе исследования все группы обследованных были разделены на 2 подгруппы: 1- лица, имеющие арг/арг-генотип р53, 2- лица, имеющие арг/про- и про/про-генотипы р53. Анализ полученных результатов по распределению вариантных генотипов исследованных генов ФБК у онкологических больных и здоровых доноров позволил установить, что общей характеристикой для всех обследованных групп (здоровые, больные РЛ, РЖ, РК, РПЖ), имеющих в генотипе про-аллель р53, явилось увеличение частоты патологических генотипов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1 по сравнению с лицами, несущими арг-аллель р53 в гомозиготном состоянии. Так, для выборки здоровых доноров с про-аллелем р53 было установлено статистически значимое увеличение частоты Иле/Вал–генотипа CYP1A1 (34,4%) по сравнению со здоровыми лицами, имеющими арг-аллель р53 (7,4% при р=0,000). У больных онкологическими заболеваниями с про-аллелем р53 при сравнении с аналогичной группой здоровых лиц статистически значимых различий по частоте вариантного генотипа CYP1A1 обнаружено не было. Однако в подгруппах больных раком легкого и раком предстательной железы, имеющих про-аллель р53, выявлялись статистически более высокие значения частоты Иле/Вал-генотипа (45,1 и 27,5% соответственно), чем у пациентов с арг/арг-генотипом р53 (8,3 и 3,8%, соответственно, при р=0,000), что подтверждалось высокими значениями OR (9,10, CI95%=4,26-19,85 и 19,34 CI95%=2,61-398,79, соответственно). Частота 0/0-генотипа генов GSTT1 и GSTM1 значительно чаще встречалась у здоровых лиц с про-аллелем р53 (27,1 и 54,2% соответственно), при этом она оказалась статистически более низкой, чем у больных раком легкого с аналогичным генотипом р53 (54,1 и 72,9%, соответственно, при р<0,01). Риск развития рака легкого при таком неблагоприятном сочетании про-аллеля р53 и функционально неполноценного GSTT1 составил 3,17 (CI95%=1,72-5,85), GSTM1 - 2,28 (CI95%=1,25-4,19). Среди больных раком легкого выявленные у пациентов с арг- и про-аллелем р53 достоверные различия в распределении вариантных генотипов касались только гена GSTM1 (50,4 и 72,9%, соответственно). Частота патологических генотипов GSTT1 и GSTM1 у больных раком толстой кишки с про-аллелем р53 обнаруживалась значительно чаще, чем у пациентов без мутации онкосупрессора (35,1, 67,6 и 6,9 и 37,9%, соответственно, при р<0,05). Как показали результаты проведенного нами исследования в группе больных раком желудка, у пациентов с про-аллелем р53 определялось увеличение частоты функционально неполноценного генотипа только по гену GSTT1 (16,9% при р=0,03).

У больных РПЖ с про-аллелем р53 была установлена статистически более высокая частота функционально неполноценного генотипа гена GSTP1 по сравнению со здоровыми лицами, имеющими про-аллель р53 (68,8 и 46,9%, соответственно, при р=0,005), при этом риск развития РПЖ возрастает в 2,49 раза (CI95%=1,28-4,87). Внутригрупповых различий в распределении вариантных генотипов GSTP1 при РПЖ выявлено не было, как, например, при раке легкого, когда частота патологических генотипов у пациентов с про-аллелем р53 обнаруживалась в 1,5 раза чаще, чем у больных РЛ с арг/арг-генотипом р53 (р=0,008).

Таким образом, на основании данных о множественном интенсивном мутагенезе р53 у онкологических больных высказано мнение [Жаров А.А., Новичкова Н.И., 2005], что экспозиция мутагенов внешней среды является важным фактором индукции мутационных процессов посредством негативного влияния на белковые компоненты репарационной системы, стресс-активации транскрипционной активности гена р53 с превращением его в активно мутирующий ген [Белявская В.А. и соавт., 2006]. Обнаруженный нами мутагенез гена р53 у онкологических больных можно объяснить влиянием широкого спектра экзомутагенов и эндогенных мутагенов воспалительного генеза, возникающих в организме при действии повреждающих агентов [Breton J. et al., 2003; Имянитов Е.Н., 2007].

На сегодняшний день является общепризнанной многоударная модель канцерогенеза, и все злокачественные новообразования расцениваются как сложные патологические процессы, в патогенез которых включено повреждение многих генов. Исследуя риск, связанный с комбинациями инактивированных вариантов генов глутатион-S-трансфераз, мы можем подтвердить сложность основных механизмов развития злокачественных новообразований. Нами была предпринята попытка построить анализ данных таким образом, чтобы оценить суммарный вклад повреждения нескольких генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в канцерогенез.

При анализе данных исследования все генотипы были разделены на протекторные (защитные), снижающие риск развития рака, интактные (не влияющие на развитие заболевания), и рисковые, статистически значимо повышающие риск развития злокачественного новообразования у здоровых носителей данного генотипа.

Установлено, что среди обследованных нами больных раком легкого генотип CYP1A1Иле/Иле/GSTT10/GSTM10/GSTP1/del105 встречался у 9 пациентов, в группе контроля он обнаруживался лишь в одном случае из 231 (р=0,037). Риск развития рака легкого у лиц с таким неблагоприятным сочетанием генотипов возрастает в 8,4 раза (CI95% 1,08-178,71). К предрасполагающим следует также отнести комбинации: CYP1A1Иле/Вал/GSTT1+/GSTM10/GSTP1/del105, CYP1A1Иле/Вал/GSTT10/GSTM10/GSTP1/del105, CYP1A1Иле/Вал/GSTT10/ GSTM10/GSTP1del105/del105, которые регистрировались у больных раком легкого и вовсе не обнаруживались у здоровых лиц (p<0,05).

Протекторную роль в развитии онкопатологии, в частности рака легкого, выполняют следующие сочетания генотипов:

CYP1A1Иле/Иле/GSTT1+/GSTM1+/GSTP1/GSTP1, СYP1A1Иле/Вал/GSTT1+/ GSTM1+/GSTP1/GSTP1, CYP1A1Иле/Иле/GSTT1+/GSTM10/GSTP1/GSTP1, CYP1A1Иле/Иле/GSTT1+/GSTM1+/GSTP1/del105 (при р<0,05, OR=0,00-0,51).

Все остальные комбинации для рака легкого оказались интактными.

Таким образом, исходя из полученных результатов, можно заключить, что фактором устойчивости к развитию рака легкого является сбалансированное сочетание вариантных генотипов ферментов первой и второй фаз биотрансформации (например, повышение активности CYP1A1 вследствие мутации компенсируется гармоничным функционированием ферментов детоксикации), для формирования риска рака легкого имеет значение дисбаланс активации/детоксикации ксенобиотиков. Среди больных раком легкого встречаются лица, имеющие нормальную или повышенную активность цитохрома Р-4501А1 на фоне значительного нарушения работы ферментов детоксикации в результате мутационных изменений двух и более изоформ глутатионтрансфераз.

При распределении предрасполагающих сочетаний генотипов у больных раком легкого в зависимости от наличия очагов регионарного метастазирования было установлено, что у пациентов, имеющих метастазы, обнаруживалось увеличение данного показателя по сравнению с таковым у больных без метастазов, при этом статистические различия между выборками больных с метастазами и без таковых были показаны для комбинаций CYP1A1Иле/Иле/GSTT1+/GSTM1+/

GSTP1del105/del105 и CYP1A1Иле/Вал/GSTT1+/GSTM10/GSTP1del105/del105.

При оценке распределения неблагоприятных генотипов у больных раком легкого в зависимости от гистологического типа опухоли нами было показано, что для больных немелкоклеточным раком легкого характерно увеличение частоты предрасполагающих комбинаций, содержащих мутированный аллель гена цитохрома Р-450 и функционально неполноценный генотип GSTM1: CYP1A1Иле/Вал/GSTT10/GSTM10/GSTP1/GSTP1 (3,8%), CYP1A1Иле/Вал/GSTT1+/ GSTM10/GSTP1del105/del105 (2,4%), CYP1A1Иле/Вал/GSTT10/GSTM10/ GSTP1del105/ del 105 (7,2%), у больных мелкоклеточным раком легкого данные комбинации встречались в 2,2; 0,0 и 4,3% случаев соответственно. Полученные нами данные можно объяснить тем, что в этиопатогенезе немелкоклеточного рака легкого принимают участие полиароматические углеводороды, которые в норме подвергаются активации с участием ферментов цитохрома Р-450 и детоксикации глутатионтрансферазой М1. Повышение активности CYP1A1 вследствие замены изолейцина на валин и нарушение работы ферментов второй фазы биотрансформации из-за делеции генов GST способствуют более длительному нахождению промежуточных продуктов метаболизма ксенобиотиков (активные формы), которые вызывают различные соматические мутации ДНК, в том числе в гене р53, в генах репарации и пр., и таким образом могут принимать участие в злокачественной трансформации клетки.

Это предположение подтверждают полученные нами данные при изучении полиморфизмов генов CYP1A1, GSTT1, GSTM1 у больных раком легкого под влиянием фактора курения, которое мы провели, основываясь на клинико-эпидемиологических наблюдениях. При этом было обосновано, что курение является немаловажным фактором риска рака легкого, гортани, пищевода, почек, мочевого пузыря и, возможно, молочной железы [Bartsh H., 2000;Braitwaite K.L., Rabbits P.H., 2000; Давыдов М.И., Полоцкий Б.Е., 1994; Харченко В.П., Кузьмин И.В., 1994; Зырянов Б.Н. и соавт., 1997; Левшин В.Ф., Заридзе Д.Г., 2003; Давыдов М.И., 2008; Кушлинский Н.Е., 2008; Чиссов В.И. и соавт, 2009]. Как известно, табачный дым содержит около 4000 соединений [Wang S.S., Samet J.S., 1997;Левшин В.Ф., Заридзе Д.Г., 2003; Заридзе Д.Г., 2005; Белицкий Г.А., 2006] и является модельной средой, воздействие которой позволяет идентифицировать многие гены, участвующие во взаимодействии организма с окружающей средой.


загрузка...