Молекулярная визуализация физико-химических процессов в живых системах при помощи биосовместимых зондов: новые подходы (06.07.2009)

Автор: Богданов Алексей Алексеевич

Данный пример доказывает, что т.н. статические эффекты самотушения в случае ковалентных макромолекулярных конъюгатов должны преобладать над динамическими. Образование нефлуоресцирующих комплексов вида Ф.Ф в основном состоянии молекул сопровождается поглощением света и возвращением в основное состояние без испускания фотона. В отличие от динамического тушения, статическое тушение уменьшается, а не увеличивается с ростом температуры, т.к. константа ассоциации флуорохромов КS=[Ф.Ф]/Ф*Ф зависит от температуры. Концентрация флуорохрома в растворе в упрощенном случае самотушения димеров: [Ф0] =[Ф]+[Ф.Ф], где [Ф]- концентрация флуоресцентных мономеров, а [Ф.Ф] концентрация нефлуоресцентных димеров. Зависимость соотношения интенсивностей флуоресценции в отсутствие эффекта самотушения F0 и наблюдаемой величины флуоресценции в присутствие эффекта самотушения F по закону Штерна-Фольмера: F0/F=1+ КS *[Ф]. В общем случае, самотушение вызывается суммарным эффектом динамического и статического самотушения и F0/F=1+ Кнабл *[Ф], где наблюдаемая Кнабл=( KD+ КS ) + KD* КS*[Ф], где KD константа тушения Штерна-Фольмера. Данные теоретические соображения распространяются и на флуоресцентные красители с максимумом флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне световых волн. Эти флуорохромы, крайне легко образуют нефлуоресцентные «агрегаты» молекул в крайне близком, т.е. Ферстеровском расстоянии друг от друга. Агрегацию обычно предотвращают путем специальной модификации с образованием ковалентно связанных сульфо групп для увеличения суммарной полярности молекул. Тем не менее, благодаря небольшому спектральному сдвигу Стокса и наличию неполярных сопряженных метиновых двойных связей данные флуорохромы легко подвергаются самотушению. Данный факт был использован нами при разработке высокомолекулярных наносенсоров для визуализации протеолитической активности (Гл. II ).

ГЛАВА III. МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ АГЕНТЫ («НАНО-ЗОНДЫ») ДЛЯ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ В ЖИВЫХ СИСТЕМАХ

III.А ПОЛИМЕРНЫЙ БИОСОВМЕСТИМЫЙ НОСИТЕЛЬ (PGC) ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ МЕТОК

Постановка задачи. МРТ позволяет достичь высокого пространственного разрешения, приближающегося к одноклеточному (шкала 80-160 мкм); и позволяет получать изображения тканей организма с характерными различиями благодаря высокому уровню контрастирования за счет различий во временах релаксации протонов. Времена релаксации различаются вследствие действия нескольких факторов: 1) концентрации протонов в ткани (спиновой плотности); 2) времен релаксации Т1 и Т2. МРТ позволяет дифференцировать различные компартменты в тканях благодаря различиям во временах протонной релаксации в результате действия следующих факторов: 1) присутствие парамагнитного железа, связанного с апогемоглобином и трансферрином, и, в меньшей степени, марганца супероксид-дисмутазы эритроцитов, 2) благодаря наличию кровотока, т.е. циркуляции протонов воды в крови, В настоящее время известен ряд подходов, основанных на эффекте изменения протонной релаксации, вызываемых компартментализацией либо эндогенных (дезоксигемоглобин), либо экзогенных контраст генерирующих веществ. В качестве экзогенных КВ в данном случае используются либо КВ, содержащие нанокристаллический магнетит Fe3O4, либо парамагнитные хелатированные комплексы Gd(III), введенные в кровоток в виде концентрированного болуса. Данные КВ способны индуцировать дальние (микрометровые) локальные возмущения магнитного поля в объеме сосудов и, следовательно, приводить к возрастанию спин-спиновой релаксивности в кровотоке (?R2*). Возрастание релаксивности в этом случае сильно зависит от изменения магнитной восприимчивости (??), и наличие данных изменений позволяет определять гемодинамические параметры (обьем крови). Тканевый обьем крови (т.е. обьем крови в вокселе, регистрируемый с помощью МРТ) измеряется путем интегрирования ?R2* после внутривенного введения КВ (логарифм изменения интенсивности МРТ сигнала пропорционален концентрации КВ в вокселе).

Тем не менее, несмотря на применимость на практике, метод, основанный на изменении магнитной восприимчивости обладает несколькими недостатками: 1) абсолютные значения объема можно определить только после забора образцов крови; 2) низкомолекулярныe КВ, которые представляют собой единственный класс КВ, разрешенных для клинического применения, быстро преодолевают эндотелиальные барьеры, что не позволяет проводить кинетические измерения в кровотоке с помощью МРТ без превышения дозы.

Необходимость неинвазивного мониторинга объема крови в качестве биомаркера ангиогенеза и антиангиогенеза при разработке новых экспериментальных методов терапии рака и воспалительных болезней требовала от нас решения задачи по разработке и применению на практике долгоциркулирующего КВ, которое бы обладало биосовместимостью и позволило бы избежать приведенных выше недостатков.

Результаты и обсуждение. В 1992 г. мы разработали первый биосовместимый синтетический парамагнитный зонд с размерами наночастицы (5-10 нм). Данное КВ, получившее название Protected Graft Copolymer (PGC), было успешно использовано, и мы продемонстрировали его применимость для визуализации сердечно сосудистой системы при помощи МРТ (Рис. 4А). Мы установили, что PGC обладает высокой стабильностьюотсутствие компонентов плазмы, которые вызывают медленное расщепление PGC, способствующее его выведению из организма (Рис. 4Б-Г). Мы также показали, что PGC можно использовать для доставки контрастных агентов к поверхности эндотелия, а также в областях локально повышенной проницаемости стенки сосудов, и, в конечном итоге, в межтканевое пространство опухолей (Табл. 1).

Рис. 4. Макромолекулярный нано-зонд, полученный на основе биосовместимого полимера (конъюгата полилизина и полиэтиленгликоля) [1,3,8]. А-3-мерная схематическое изображение макромолекулярного контрастирующего зонда (PGC); Б- профили биораспределения PGC в модели рака молочной железы R3230 у крыс 6-120 часов после внутривенного введения. Наблюдалось медленное выведение PGC из кровотока, и увеличение накопления в опухоли, почках и селезенке В-гельпроникающая ВЭЖХ образца PGC до и после 24 ч инкубации в нормальном физиологическом растворе, pH 7.4. PGC был мечен изотопом [111In; Г -хроматограмма образца PGC до и после 24 ч инкубации в присутствии 50% плазмы крови человека, стрелка указывает на смещение пика элюции PGC в область макромолекул меньшего диаметра.

Таблица 1. Физико-химические и фармакокинетические характеристики PGC-Gd [1,3,8].

Параметр Gd-PGC

Формула (приблизительная) MPEG92-PL-GdDTPA187

Масса (ВЭЖХ) 560 кДа

Диаметр (корреляционая спектроскопия) 10.3±2 нм

Релаксивность (спин-решеточная), r1 18 мM с-1

Время полужизни в кровотоке, (t1/2) 36 ч

Объем биораспределения 0.04 л/кг

Экстракция из кровотока, начальная Не наблюдалась

Связывание с белками плазмы Не обнаружено

Иммунный ответ (иммуноглобулины G+M, иммуноанализ) на GdДТПК, доза 0.01 ммоль Gd/кг, 2 недели после инъекции. Не обнаружен

Свойства PGC приведены в таблице 1. Полученный на основе ковалентной модификации метоксиполиэтиленгликолем ?-аминогрупп полилизина графт-сополимер PGC был впоследствии применен в ряде МРТ исследований в различных моделях (Таблица 2). Наиболее часто использовалось производное ковалентной модификации PGC диангидридом диэтилентриаминопентауксусной кислоты (ДТПК) с хелатированным Gd(III).

Таблица 2. МРТ исследования с применением долгоциркулирующего сополимера PGC, меченого катионами лантанидов (Gd или Dy).

Вид экспериментальных животных, Модель заболевания МРТ режим получения изображений

Основные выводы

CD крысы, balb/c мыши, токсикология, МРТ эффективность 1.5Т градиент эхо (3D-SPGR) Контрастирующий эффект наблюдался при внутривенной дозе 25 мкмоль Gd /кг . Нетоксичен в мышах и крысах. [1]

Кролик, модель эмболизма легочных артерий 1.5Т (3D-SPGR) PGC дает возможность контрастировать разветвление легочных артерий вплоть до 4го уровня. [2]

Крыса. Модель кровотечения стенки тонкого кишечника 1.5Т (3D-SPGR) Определен минимальный объем крови в кишечнике, детектируемый с помощью МРТ в после внутривенного введения PGC (50 мкл). [4]

Крыса. Глубокое воспаление феморальной мышцы 1.5Т (3D-SPGR) Установлено, что МРТ/PGC дает возможность наблюдать очаг воспаления 72 часа после введения PGC. Накопление PGC в очаге превышает в 8 раз уровень в нормальной мышце. [5]

Крыса. Глиома головного мозга 1.5Т (3D-SPGR) Определены условия, при которых можно точно и воспроизводимо измерять объем крови в ткани с учетом кинетики обмена протонов воды. [6]

Крыса, мышь. Модели рака. 1.5Т (3D-SPGR) Произведено определение транс- хелатирования катионов связанных с PGC и расщепление PGC в плазме крови и произведена визуализация PGC в опухолях [8]

Крыса. Глиома 1.5Т (3D-SPGR) Разработан подход к определению объема крови и общего объема межклеточного объема. В модели экспериментальной глиомы продемонстрирован эффект блокирования ангиогенеза под воздействием пептидов тромбоспондина-1 (TSP-1). [8,9,11, 14]

Крыса. Ишемия головного мозга 4.7Т (ASL, SE) Разработан новый МРТ метод для одновременного определения объема крови, скорости тока крови и степени экстракции воды из кровотока при помощи МРТ/PGC-Dy. [12,15]

Мышь. Аденокарцинома молочной железы. 1.5Т 3D-SPGR Измерены различия в объеме крови опухоли MCF7 и клона с высоким уровнем экспрессии фактора роста сосудов (VEGF). [17]

Мышь . Аденокарцинома простаты 1.5Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла) Предложен метод измерения объема крови и объема интерстициального пространства в опухолях при помощи PGC. [22,24]

Мышь. Аденокарцинома кишечника 9.4Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла) Количественно оценено уменьшение объема крови в опухоли на ранней стадии лечения ингибитором киназы рецептора фактора роста сосудов. [29]

Мышь. Модель диабета 1го типа (инсулит). 9.4Т 3D-GEFC

(компенсация кровотока) Проведена МРТ ангиография высокого разрешения, продемонстрирована экстравазация PGC-Gd, меченого флуоресцеином, в области островков Лангерганса. [38]

Мышь. Ишемия полушария головного мозга. 9.4Т 3D-SPGR

(варьирование флип угла) Измерены барьерные свойства гематоэнцефалического барьера до и после экспериментальной ишемии (инсульта). [43]


загрузка...