Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК (05.10.2009)

Автор: Вербенко Валерий Николаевич

CspG 42 efrtlnenqkvefsieqgqrgpaaanvvtl* 70

Gam12 (CspG() ------------------------------

СspA( 42 gcnpgsatehssv*

CspA 42 YKSLDEGQKVSFTIESGAKGPAAGNVTSL* 70

Рисунок 10. Выравнивание аминокислотных последовательностей, полученных трансляцией локусов cspG, gam12, cspA со вставкой кассеты Tn903 и cspA. Курсивом показаны остатки, образующие мотивы связывания с РНК и ДНК (Schindelin, 1994). Аминокислоты, отличающие CspA от CspG, подчеркнуты; аминокислоты, появившиеся из-за сдвига рамки считывания, подчеркнуты волнистой линией.

Мутация gam12 не затрагивает мотивов белка kgfgfi и vfvhf, которым приписывается роль в связывании ДНК и РНК (Schindelin et al., 1994). Белки субсемейства CspA на 43% идентичны “домену холодового шока” эукариотических белков семейства “Y-блока” (Y-box). Все эти белки обладают способностью связываться с нуклеиновыми кислотами, влияя на транскрипцию, репликацию и репарацию или на эффективность трансляции мРНК.

Не исключая разные механизмы действия БХШ на экспрессию генов и синтез белка, мы проанализировали распределение в геноме E. coli нуклеотидного мотива ССААТ и комплементарного ATTGG с помощью программы Search. Список существенных генов, содержащих этот мотив в 5’-регуляторной области (меньше, чем 100 п.н. от блока -35), в промоторе (между блоками -10 и -35), в 5’-нетранслируемом районе РНК и структурной части гена представлен в таблице 6. Эти гены можно разделить на семейство генов собственно холодового шока: сspA, cspB, сspC, cspD, cspE, cspF, cspG, cspH, cspI, csdA, и rbfA; теплового шока: rpoH, dnaKJ, grpE, groES, htpG, lon, clpB, clpP, ddg, dksA, hslV, hslJ, htrA, htrC, ibpA, ibpB; гены репликации и клеточного деления: dnaA, dnaN, dnaX и ftsQ; регуляторные гены: oxyR, rpoS, ompR, osmC, hns, stpA (гомолог hns), asr, arcB, hipA, hupA, gcpE, greB и rob; и гены систем репарации и рекомбинации: recA, alkA, dinG, gyrA, polB, recC, recF, recO, recR через dnaX, recN, ruvA, ssb, uvrA, uvrB, uvrD и sulA. Вне нашего рассмотрения остаются гены метаболизма и транспорта, тоже содержащие мотивы ССААТ.

Таблица 6.

Классификация генов E. coli с областями, содержащими последовательность

Y-бокс для связывания СspA-подобных белков

Функция Гены/положение

5’-UAS Промотор 5’-UTR Структурная часть

Белки холодового шока cspF* сspA*, сspC* cspB*, cspD*, cspE* csdA, cspA*, cspB*, cspC*, cspD*, cspE*, cspF*, cspG*, cspH*, cspI*, rbfA

Белки теплового шока dnaKJ, grpE

dnaKJ, htpG*, clpB*, clpP, ddg*, dksA, dnaK, groES*, grpE, hslV, hslJ, htpG*, htrA, htrC, ibpA, ibpB, lon, rpoH

Системы репарации, рекомбинации, репликации и клеточного деления alkA, gyrA*, dnaA, recO, ssb, uvrA, ruvA recO, polB, ssb, ftsQ recC*, recF, recR через dnaX, uvrD, dinG(, ssb, ftsQ, dnaN, dnaX dinG*, gyrA*, polB, recA*, recF, recN, ruvA, ssb, ung, uvrA, uvrB, uvrD, intA, intB, ftsJ, ftsQ, dnaA, dnaN, dnaX, sulA

Регуляторные белки hns*, stpA, hipA, gcpE, ompR* arcB hns*, oxyR, rob, gcpE, greB asr, hns*, hupA, oxyR, ompR*, osmC, rob, rpoS, stpA

* - изменение экспрессии при холодовом шоке подтверждено протеомным анализом (Phadtare and Inouye, 2004).

Таким образом, нами идентифицирована рецессивная мутация gam12 из высокорадиоустойчивого штамма E. coli Gamr444. Эта мутация находится на 22,68 мин хромосомы в кластере генов cspH-cspG и по меньшей мере затрагивает ген cspG, вызывая сдвиг открытой рамки считывания с образованием стоп-кодона. Не исключено, что мутантный белок холодового шока CspG( принимает участие в регуляции экспрессии стрессовых систем клетки при низкой температуре аналогично укороченному белку CspA(.

Заключение. Устойчивость бактерий к наиболее опасному типу повреждений ДНК – двунитевым разрывам, определяется эффективностью рекомбинационной репарации. Современная модель рекомбинационной репарации двунитевых разрывов у E. coli основывается на RecBCD-зависимом пути репарации, сопряженном с реинициацией репликации, а RecF-пути отводит роль в репарации брешей или альтернативного механизма в отсутствие экзонуклеаз V и I. В данной работе представлены доказательства того, что, по крайней мере, у радиоустойчивых мутантов Escherichia coli Gamr возможно одновременное функционирование обоих путей репарации и только смешанный RecBCD-RecFOR-путь репарации способен исправлять множественные двунитевые разрывы в геноме этих бактерий.

Полученные данные говорят об эволюционном консерватизме унифицированного механизма рекомбинационной репарации повреждений ДНК у бактерий с повышенной устойчивостью к ДНК-тропным агентам. Предполагается, что высокая резистентность к ДНК-повреждающим агентам у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки достигается формированием смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: активация геликазы на RecF-пути сопровождается ограничением активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути. Дополнительно белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную роль в ренатурации ключевых белков репарационных систем, деградации аберрантных белков и в регуляции экспрессии как SOS-регулона, так и аддитивных стрессовых систем.

Можно предложить следующий механизм реакции радиоустойчивых мутантов на действие ионизирующей радиации. Гамма-облучение вызывает повреждение ДНК и других компонентов клеток радиоустойчивого штамма, что является сигналом для частично конститутивных Gamr-функций (рис. 11). Активация этих функций приводит к изменению экспрессии генов SOS-системы репарации и RecF-пути рекомбинационной репарации, нарушению репликации и клеточного деления, изменению метаболизма, появлению устойчивости к окислительным агентам, усилению синтеза ренатурирующих белков, АТФ-зависимых протеаз и РНК-шаперонов и, возможно, других гипотетических систем. В итоге эти события приводят к повышению эффективности репарации потенциально-летальных повреждений ДНК и росту выживаемости клеток.

Рисунок 11. Реакция клеток радиоустойчивой бактерии на воздействие ионизирующей радиации.

Штаммы бактерий, имеющие пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК, для исправления летальных повреждений при низких дозах не нуждаются в белке PriA и обширном ресинтезе, сопровождающем RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов. Однако при более высоких дозах (( 500 Гр) этот путь репарации становится существенным и у радиорезистентных мутантов.

Радиоустойчивость мутанта E. coli Gamr444 зависит от индуцибельной cистемы SOS-репарации и конститутивного RecBCD-зависимого пути репарации разрывов ДНК. Вместе с тем, установлено, что мутации recO, recR, recQ, helD и uvrD, затрагивающие альтернативный RecF-путь репарации, гораздо сильнее сенсибилизируют мутант Gamr444, чем штамм дикого типа.

Обнаружено понижение уровня экзонуклеазной деградации ДНК в необлученных клетках штамма Gamr444 как прямым измерением экзонуклеазной активности фермента RecBCD, так и косвенным методом оценки выживаемости фагового мутанта T4 2-.

Свойства плазмиды pGam26, несущей клонированный мутантный аллель gam26 штамма Gamr444, свидетельствуют о том, что его продукт способен ограничивать экзонуклеазную активность RecBCD в необлученных клетках дикого типа. Картирование показало, что он не совпадает с геном recA, который кодирует белок RecA, ингибирующий пострадиационную экзонуклеазную деградацию ДНК.

Мутантный аллель gam18 радиорезистентного мутанта Gamr444, клонированный на плазмиде pGam18, повышает выживаемость ?-облученных клеток recBC- sbcB-, т.е. активен на RecF-пути рекомбинационной репарации.

Частичная компенсация плазмидой pGam18 радиосенсибилизирующего эффекта мутаций в гене uvrD, кодирующем ДНК-геликазу II и также относящемся к RecF-пути, позволяет предположить, что мутантный аллель gam18 повышает ДНК-геликазную активность на предсинаптической стадии RecF-пути репарации ?-индуцированных двунитевых разрывов ДНК.

Природная плазмида pSD89, выделенная из штамма S. derby, повышает радиоустойчивость клеток E. coli дикого типа, значительно компенсирует дефект по репарации в мутантах recA и polA, но не uvrA и umuC и несет гомолог гена polA.

Повышенный базальный уровень основных белков теплового шока, а именно: DnaJ, CbpA, GrpE, ClpB, Lon, и в особенности DnaK, вызывает рост радиоустойчивости мутантов Gamr.

Мутация в SOS-блоке оператора гена recA, снижающая связывание репрессора LexA, приводит к накоплению белка RecA в клетках и к росту устойчивости к летальному действию ионизирующей радиации и ультрафиолетового света.

Экспрессия гена recA высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии Deinococcus radiodurans не компенсирует делецию гена recA грамотрицательной бактерии Escherichia coli K-12.

Модифицированные белки CspA( и CspG( системы холодового шока повышают устойчивость клеток E. coli дикого типа, а CspG( также и радиоустойчивого мутанта Gamr444 к летальному действию ионизирующей радиации и УФ-света, активируя синтез белков холодового шока, теплового шока и RecA-зависимых функций, в частности белков RecF-пути репарации.

Доказано существование у радиоустойчивых мутантов кишечной палочки смешанного RecBCDFOR-пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК, на котором происходит перераспределение ролей RecBCD- и RecF-путей в пользу последнего: ограничение активности экзонуклеазы V на RecBCD-пути создает условия для RecF-пути, который дополнительно стимулируется активацией геликазы. При этом белки стрессовых систем теплового и холодового шока выполняют вспомогательную и регуляторные роли в ренатурации или протеолизе поврежденных белков и избирательном усилении экспрессии генов.

Список публикаций по материалам диссертации.

Журналы, рекомендованные ВАК:

Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Бикинеева Е.Г., Калинин В.Л. Влияние мутаций в структурных генах белков теплового шока на радиорезистентность Escherichia coli. – Генетика, 1992, т. 28, №No 2, с. 99-110.

Вербенко В.Н., Кузнецова Л.В., Калинин В.Л. Мутантные аллели радиорезистентности штамма Gamr444 Escherichia coli: клонирование и предварительная характеристика. – Генетика, 1994, т. 30, №No 6, с. 756-762.

Вербенко В.Н., Калинин В.Л. Рост радиоустойчивости бактериофагов как результат усиления экспрессии стрессовых систем клетки-хозяина. – Генетика, 1995, т. 31, №No 12, с. 1630-1636.


загрузка...