Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК (05.10.2009)

Автор: Вербенко Валерий Николаевич

Сравнение радиозащитных свойств плазмид с различными аллелями гена recA в клетках E. coli

Штамм -В

(кГр-1) ФИД

АB1157 3,058(0,087

Z905 (recA 27,820(1,797 0,110

Z905 (recA/pKSrec30 24,771(0,512 0,123

Z905 (recA/pKSrec30 + IPTG 28,351(0,749 0,109

Z905 (recA/pKS5 23,714(1,120 0,129

Z905 (recA/pKS5 + IPTG 22,310(0,964 0,137

Z905 (recA/pUC19-recА1.1 3,401(0,051 0,899

recA56 39,514(1,210 0,077

recA56/pKSrec30 30,286(0,659 0,010

recA56/pKSrec30 + IPTG 31,371(0,732 0,097

recA56/pKS5 30,929(1,402 0,099

recA56/pKS5 + IPTG 26,700(1,389 0,115

ssb-1 4,912(0,183 0,623

ssb-1/pKSrec30 6,001(0,183 0,510

ssb-1/pKSrec30 + IPTG 5,334(0,024 0,573

ssb-1/pKS5 4,702(0,039 0,650

ssb-1/pKS5 + IPTG 4,330(0,099 0,706

Белок RecA из высокорадиоустойчивой грамположительной бактерии D. radiodurans не способен компенсировать делеционную мутацию в гене recA грамотрицательной бактерии E. coli K-12. Однако после серии облучений возрастающими дозами гамма-радиации клеток E. coli (recA, несущих плазмиды с recADR и recA670DR, получены мутантные аллели recA-300 и rec30-212, дающие радиозащитный эффект при гамма- и УФ-облучении.

Сравнение белков RecA E. coli и D. radiodurans показывает значительную степень подобия этих белков (~ 57%). Наибольшие отличия заключаются в N-концевом фрагменте из 16 аминокислот и С-концевой части белка.

ПОВЫШЕННАЯ РАДИОРЕЗИСТЕНТНОСТЬ И БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА.

Методом одномерного электрофореза в полиакриламидном геле обнаружено, что у радиорезистентных мутантов Gamr444 и Gamr445 Escherichia coli K-12 высокомолекулярные белки теплового шока гиперпродуцируются при 32-37° С и более интенсивно синтезируются при тепловом шоке (по сравнению с родительским штаммом АВ1157). При введении в геном штамма Gamr444 миссенс-мутации htpR15 в позитивном гене-регуляторе белков теплового шока его повышенная радиорезистентность исчезает, но восстанавливается при введении в штамм Gamr444 htpR15 плазмиды pKV3, несущей ген htpR+. Эти данные указывают на участие белков теплового шока в обеспечении повышенной радиорезистентности мутантов Gamr.

Ранее (Бреслер C.Е. и др., 1984в) нами показано, что в эффективной репарации ?-индуцированных летальных повреждений у гиперрадиорезистентных мутантов Gamr E. coli определяющую роль играет rесА+, 1ехА+-зависимая система SOS-репарации, в том числе сам продукт гена rесА, а также какие-то отличные от RecA SOS-индуцируемые функции. Мы высказали предположение о повышении индуцибельности генов SOS-системы у этих мутантов и о существовании у них конститутивных (не зависящих от 1ехА+) факторов, ограничивающих пострадиационную деградацию ДНК. С целью проверки этих гипотез мы решили сравнить белковый состав клеток мутантов Gamr и родительского штамма АВ1157 до и после ?-облучения, надеясь обнаружить гипериндукцию SOS-функций. Оказалось, однако, что мутанты Gamr отличаются от дикого типа не столько по SOS-белкам, сколько по компонентам другой стрессовой системы – белкам теплового шока (БТШ) (Neidhardt F.С. et al., 1984). Данная работа посвящена доказательству участия системы БТШ в повышенной радиорезистентности мутантов Gamr.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ

?-Индуцированный синтез белка RecA.

Типичная картина электрофоретического распределения белков в валовых лизатах клеток высокоустойчивого штамма Gamr444 представлена на рисунке 00. ?-Облучение индуцирует синтез белка с мол. массой ~ 40 кД, который по всем признакам является белком RecA. Синтез этого белка усиливается уже через 5 мин после ?-облучения и ослабевает через 30 мин при дозе 0,1 кГр и через 60 мин при дозе 0,2 кГр. При более высокой дозе повышенный уровень экспрессии белка RecA наблюдается в течение 3 ч после облучения. У мутанта Gamr445, имеющего промежуточный уровень радиорезистентности, уже небольшая доза (50 Гр) вызывает усиленный синтез белка RecA, который продолжается в течение 60 мин (Рис. 00, а). В клетках дикого типа максимальная скорость синтеза белка RecA достигается только через 30 мин после облучения дозами 25 – 100 Гр (см. Рис. 00, б), что согласуется с литературными данными /00p?/. (Рис. 00, 00,00, 00 см. вкл. стр. 000).

В целом наблюдающиеся различия в кинетике синтеза белка RecA в ?-облученных клетках коррелируют с их радиоустойчивостью. Так, при ?-облучении клеток Gamr444 и Gamr445 одинаковой дозой 0,1 кГр (Рис. 00) синтез белка RecA прекращается через 30 мин у высокорезистентного мутанта и продолжается в течение 60 мин у менее ?-резистентного штамма. Ранее мы показали, что начальный уровень ?-индуцированных повреждений ДНК в клетках мутантов Gamr и дикого типа одинаков (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Можно предположить, что более раннее выключение синтеза RecA у наиболее радиорезистентного мутанта отражает более эффективную репарацию повреждений ДНК, в том числе участвующих в индукции SOS-системы.

Белки теплового шока у мутантов Gamr.

Наиболее существенным отличием мутантов Gamr от клеток дикого типа оказались очень хорошо заметные полосы белков с мол. массами 94, 84, 66 и 56 кД (см. Рис. 00 – 00), интенсивность которых не зависела от ?-облучения и усиливалась при продолжительном росте клеток в среде ЕМ9 при 37 или 32° С (Рис. 00, а). Сравнение с литературными данными (Neidhardt F.С. et al., 1984) позволило предположить, что этот характерный набор белков принадлежит БТШ. Мы сопоставили эти белки, наиболее отчетливо проявляющиеся у мутантов Gamr в поздней экспоненциальной фазе роста, с типичными БТШ, индуцируемыми в клетках дикого типа сразу после переноса на 43° С (см. Рис. 00, б). Оказалось, что именно эти полосы появляются у штамма АВ1157 при тепловом шоке. В клетках Gamr444 в ранней экспоненциальной фазе роста индукцию тех же БТШ вызывает перенос на 43° С, причем, как показала денситометрия радиоавтографов электрофореграмм, у этого мутанта скорость синтеза БТШ в условиях теплового шока вдвое выше, чем у дикого типа (при нормировке на количество фактора элонгации EF-Tu (Meyer R.R. et al., 1982).

Приведенные данные показывают, что полосы белков 94, 84, 66 и 56 кД, характерные для мутантов Gamr уже при нормальной ростовой температуре (32 – 37° С), принадлежат соответственно БТШ Lon, HtpM, DnaK и GroEL (Neidhardt F.С. et al., 1984). Таким образом, мутанты Gamr, по-видимому, имеют измененную регуляцию синтеза по меньшей мере главных высокомолекулярных БТШ, которые у мутантов интенсивно синтезируются уже при нормальных температурах, особенно в поздней экспоненциальной фазе, а при 43° С индуцируются более активно, чем у дикого типа.

Роль белков теплового шока в радиорезистентности штаммов Gamr. Способность к сверхсинтезу БТШ вызвала у мутантов Gamr повышение устойчивости к летальному действию высоких температур. Так, после инкубации в течение 20 мин при 55° С выживаемость выращенных при 37° С клеток составляла 2,5?10-6 для штамма АВ1157, 2,5?10-3 для штамма Gamr445 и 4?10-3 для штамма Gamr444. Аналогичное повышение терморезистентности к 55° С у клеток дикого типа достигалось при индукции БТШ во время предварительной инкубации при 43° С (Yamamori Т., Yura T., 1982).

Чтобы установить, является ли повышенное содержание БТШ у ?-резистентных мутантов случайным совпадением или же оно коррелирует с повышенной радиоустойчивостью, мы с помощью трансдукции ввели в штамм Gamr444 температурочувствительную миссенс-мутацию htpR15 (Tobe T., et al., 1984) в гене позитивного регулятора системы БТШ (Grossman A.R. et al., 1984). Это привело к исчезновению полос БТШ у сконструированного штамма Gamr444 htpR15 как в конце экспоненциальной фазы роста, так и в условиях теплового шока (см. Рис. 00, в). Двойной мутант Gamr444 htpR15 по сравнению с ?-резистентным штаммом Gamr444 имеет значительно повышенную радиочувствительность, по которой он почти не отличается от клеток АВ1157 дикого типа и донорного штамма htpR15 (Рис. 00). Отметим, что, как было показано ранее (Бреслер C.Е. и др., 1984в), последние два штамма имеют одинаковую радиочувствительность. Лишь в области низких доз на дозовой кривой выживаемости штамма Gamr444 htpR15 сохранилось небольшое плечо, выраженное гораздо менее отчетливо, чем для штамма Gamr444. Таким образом, не вызывает сомнения, что повышенная радиорезистентность штамма Gamr444 в значительной степени зависит от его способности гиперпродуцировать БТШ в нормальных ростовых условиях. Вероятно, с этой способностью связано и отсутствие у мутанта Gamr444 термоиндуцированной радиорезистентности (Бреслер С.Е. и др., 1984а), которая у клеток дикого типа вызывается предрадиационной термообработкой, приводящей к накоплению БТШ (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Сохранение небольшого начального плеча указывает на участие еще одного, htpR+-независимого фактора (возможно, конститутивного или SOS-индуцируемого ингибитора деградации ДНК (Бреслер C.Е. и др., 1984в) в радиорезистентности мутанта Gamr444.

Причины повышения “базального” уровня БТШ у мутантов Gamr окончательно выяснить не удалось. Можно было предположить, что у них изменился (-фактор РНК-полимеразы (32-продукт гена htpR (Grossman A.R. et al., 1984), который стал более активным и при пониженных температурах. Оказалось, однако, что при введении дикого аллеля htpR+ в двойной мутант Gamr444 htpR15 в составе многокопийной плазмиды pKV3 (Tobe T., et al., 1984) его радиорезистентность почти полностью восстанавливается до уровня Gamr444. Аналогичное восстановление радиорезистентности у Gamr444 htpR15 наблюдалось и при конъюгационном замещении аллеля htpR15 на htpR+, т. е. оно не было связано с повышенным числом копий плазмидного гена htpR+. Таким образом, мутации радиорезистентности, скорее всего, не затрагивают сам ген htpR, а влияют на какие-то другие факторы регуляции системы БТШ. Тем не менее можно утверждать, что повышенная радиорезистентность штамма Gamr444 требует наличия нормальной субъединицы (32 РНК-полимеразы (Grossman A.R. et al., 1984), которая в обычных условиях не нужна для радиоустойчивости (Бреслер C.Е. и др., 1984в), даже если ее ген htpR+ содержится на многокопийной плазмиде (см. Рис. 00, кривая 4).

Одним из возможных механизмов радиозащитного действия системы БТШ, уже обсуждавшимся нами в связи с эффектом термоиндуцированной радиорезистентности (Бреслер C.Е. и др., 1984в), является защита ДНК от нуклеазной деградации в пострадиационный период.

Оказалось, что этот механизм для штамма Gamr444 несуществен, по крайней мере, в области умеренных доз (до 0,6 кГр). В этом диапазоне, соответствующем плечу дозовой кривой выживаемости штамма Gamr444 htpR15, деградация ДНК в ?-облученных клетках этого штамма остается столь же низкой, как и у штамма Gamr444 (Рис. 00). Лишь при большей дозе (1 кГр) мутация htpR15 заметно усиливает пострадиационную деградацию ДНК в клетках Gamr444 htpR15, причем этот эффект исчезает при введении гена htpR+ с плазмидой pKV3. Можно предположить, что в области низких доз деградация ДНК у мутанта Gamr444 и так подавлена конститутивным или SOS-индуцируемым ингибитором (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Количество последнего, однако, становится лимитирующим при более высоких дозах, и тогда система БТШ оказывается способной выступить в роли альтернативного фактора подавления нуклеазной активности.

Таким образом, мы установили участие системы БТШ в обеспечении высокоэффективной репарации ?-индуцированных повреждений ДНК в клетках радиорезистентных мутантов Е. coli. He исключено, что механизм действия системы Htp у этих мутантов состоит в стабилизации нуклеоида повышенным количеством БТШ (Pellon J.R. et al., 1982). При этом возникающие под действием ионизирующей радиации двунитевые разрывы ДНК, защищенные от экзонуклеазной атаки и стабилизированные более плотной упаковкой нуклеоида, могут быть более эффективно исправлены в результате рекомбинационной репарации (Бреслер C.Е. и др., 1984в). Следует все же отметить, что создаваемые БТШ благоприятные для репарации условия реализуются в повышенную радиорезистентность мутантов Gamr лишь при наличии “обычных” систем репарации ДНК, включая рекомбинационные системы и rесА+, lехА+-зависимую SOS-систему (Бреслер C.Е. и др., 1984в).

3.7. Вклад белков холодового шока в радиоустойчивость.

Влияние инсерционной мутации в гене сspA, кодирующего главный белок холодового шока, на радиорезистентность клеток E. coli. Мы установили, что мутация, затрагивающая ген cspA E. coli, способна в гетерозиготном (на плазмиде) и в гомозиготном (в клеточной хромосоме) состоянии значительно повысить устойчивость к радиации клеток E. coli с нормальными системами репарации и синтеза белков теплового шока.


загрузка...