Молекулярно-генетические механизмы повышенной устойчивости бактерий к потенциально-летальным повреждениям ДНК (05.10.2009)

Автор: Вербенко Валерий Николаевич

На правах рукописи

ВЕРБЕНКО Валерий Николаевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ БАКТЕРИЙ

К ПОТЕНЦИАЛЬНО-ЛЕТАЛЬНЫМ

ПОВРЕЖДЕНИЯМ ДНК

03.00.15 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Санкт-Петербург

Работа выполнена в отделении молекулярной и радиационной биофизики Петербургского института ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Михельсон Виктор Михайлович

доктор биологических наук, профессор

Газиев Ажуб Ибрагимович

доктор биологических наук, профессор

Квитко Константин Васильевич

Ведущее учреждение: ФГУП Государственный научный центр РФ Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов “ГосНииГенетика”

Защита состоится ”____” _________ 2009 г. в ______ часов на заседании совета Д212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан ”_____”_________________ 2009 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д212.232.12

кандидат биологических наук Л.А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Молекулярно-генетические механизмы устойчивости бактериальных клеток к повреждениям ДНК представляют собой несомненный интерес как эволюционно консервативные системы защиты клеток прокариотов и эукариотов. Нерепарированные однонитевые повреждения ДНК вызывают ингибирование и дезинтеграцию репликативных вилок, приводящую к появлению потенциально-летальных двунитевых разрывов ДНК. В E. coli дезинтегрированные двунитевые вилки собираются заново благодаря RecBCD-пути рекомбинационной репарации через направляемую гомологией инвазию однонитевой ДНК в интактный сестринский дуплекс. Репарация как прямо индуцированных, так и возникших при дезинтеграции репликативных вилок двунитевых разрывов ДНК в E. coli возможна прежде всего в реплицированной части хромосомы.

Уровень радиорезистентности бактерий определяется эффективностью репарации двунитевых разрывов ДНК. Репарация двунитевых разрывов у E. coli идет по механизму гомологичной RecBCD-зависимой рекомбинации. RecBCD-путь репарации двунитевых разрывов за пределами репликативной вилки может рассматриваться как комбинация двух независимых событий репарации, вовлекающих гомологичную хромосому. RecBCD-путь рекомбинационной репарации двунитевых разрывов сопровождается значительной деградацией ДНК и ассоциирован с рестартом репликации. В клетках дикого типа возможна репарация двунитевых разрывов без участия RecBCD-пути. RecF-пути рекомбинационной репарации приписывается роль в заделке брешей, хотя и признается его способность репарировать двунитевые разрывы при выключении RecBCD-пути.

У высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans нет экзонуклеазы RecBCD и репарация двунитевых разрывов идет по RecF-пути рекомбинационной репарации, либо по гипотетическому механизму зависимого от протяженного синтеза отжига нитей. Взаимоотношения несомненно главного RecBCD-зависимого пути рекомбинационной репарации двунитевых разрывов ДНК с альтернативными RecF- и RecE-путями репарации в E. coli еще не выяснены.

Механизмы повышенной радиорезистентности снова в центре внимания:

обсуждается зависимый от протяженного синтеза отжиг нитей (ESDSA) как способ репарации двунитевых разрывов у высокорадиоустойчивой бактерии D. radiodurans,

белок RecA из D. radiodurans обладает особенными свойствами,

индукция стрессовой системы теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа,

в условиях холодового шока (при переносе с 37о на 10о) повышается дифференциальная скорость синтеза белков RесА и GyrA (субъединица А ДНК-гиразы). Белки холодового шока рассматриваются как активаторы транскрипции и РНК-шапероны,

взаимодействия стрессовых систем клетки с системами репарации повреждений ДНК до конца не изучены.

В решении актуальных вопросов могут оказаться полезными исследования мутантов кишечной палочки с повышенной радиационной устойчивостью, в которых может быть усилена функция RecF-пути при сохранении роли RecBCD-пути рекомбинационной репарации.

Моделью для молекулярно-генетического анализа факторов радиорезистентности стал радиоустойчиввый мутант E. coli Gamr444. Радиорезистентность мутанта Gamr444 зависит от recA+-lexA+-функций (Бреслер и др., 1984). Штаммы бактерий Gamr имеют пониженный уровень пострадиационной деградации ДНК (Бреслер и др., 1982). Мутация recF в большей степени снижает радиоустойчивость мутанта Gamr444, чем клеток дикого типа (Бреслер и др., 1984). Повышенный уровень белков теплового шока приводит к эффекту термоиндуцированной радиорезистентности у клеток дикого типа и rpoH-recA-зависимому росту радиоустойчивости у мутанта Gamr444 (Вербенко и др., 1986), при этом гены-регуляторы репарационной системы и белков теплового шока – recA и rpoH, соответственно, в мутантах Gamr не изменились (Бреслер и др., 1984; Вербенко и др., 1986).

Анализ штаммов Gamr позволил предположить, что усиление радиоустойчивости у мутанта Gamr444 обусловлено мутациями по меньшей мере 3 типов. Одна из них предотвращает избыточную пострадиационную деградацию ДНК, вторая повышает эффективность работы рекомбинационных систем репарации (особенно RecF) и третья повышает уровень белков теплового шока, играющих вспомогательную роль в репарации. Для того, чтобы наиболее полно изучить механизмы высокой устойчивости бактерий к ДНК-повреждающим факторам, необходимо исследовать свойства мутантных локусов, дающих фенотип Gamr.

Процесс деградации поврежденной нити ДНК играет важную роль в рекомбинационной репарации. Защиту от избыточной деградации ДНК, по-видимому могут осуществлять клеточные белки аналогичные белкам gam и gp2 фагов ? и T4. Плазмида pGam26, вероятно, несет клонированный мутантный ген, кодирующий клеточный ингибитор деградации ДНК, не совпадающий с белком RecA. Свойства этого продукта кажутся интересными для исследования.

Одним из факторов, лимитирующих репаративный потенциал бактериальных клеток, является сложный, разветвленный процесс рекомбинационной репарации. Существование различных путей рекомбинации (Clark, 1973) может приводить как к кооперативным, так и к конкурентным взамоотношениям генетических продуктов, использующих один и тот же субстрат. Полученные ранее данные указывают на то, что важной причиной повышения устойчивости клеток E. coli к летальному действию (-излучения является увеличение эффективности работы SOS-системы и RecF-пути рекомбинационной репарации (Бреслер и др., 1984). Вместе с тем взаимоотношения различных путей рекомбинации при репарации повреждений ДНК остаются невыясненными и требуют дальнейших исследований.


загрузка...