Секреторная фосфолипаза А2 группы IIА в плазме крови больных после коронарной ангиопластики: регуляция липидами и липопротеидами (05.10.2009)

Автор: Коротаева Александра Алексеевна

При воспалении циркулирующие липопротеиды могут подвергаться окислению, превращаясь в окислено-модифицированные частицы с измененным фосфолипидным составом. Впервые показано, что окисленные липопротеиды (окЛОНП, окЛНП и окЛВП) стимулируют активность секФЛА2(IIA), устраняя ингибирующий эффект нативных липопротеидов. Влияние окисленных липопротеидов на активность секФЛА2(IIA) зависит от степени изменения их фосфолипидного состава, вызванного окислением.

Впервые показано, что сфингомиелин, содержащийся во всех классах липопротеидов, ингибирует секФЛА2(IIA). При окислении в липопротеидах может образовываться окисленный фосфатидилхолин, который, в отличие от сфингомиелина, активирует секФЛА2(IIA). Сфингомиелин конкурирует с окисленным фосфатидилхолином за связывание с секФЛА2(IIA), и изменение соотношения между концентрациями этих фосфолипидов в составе нативных и окисленных липопротеидов может влиять на регуляцию секФЛА2(IIA) в сыворотке крови человека, приводя либо к ингибированию, либо к стимуляции её активности.

Холестерин и эфиры холестерина, входящие в состав липопротеидов, не оказывают влияния на активность секФЛА2(IIA).

Сделано предположение, что изменение активности секФЛА2(IIA) под действием нативных и окисленных липопротеидов может влиять на развитие рестеноза коронарных сосудов.

Практическая значимость: Полученные данные расширяют представления о молекулярных механизмах развития рестеноза, в основе которых лежат воспалительные процессы. Так как воспаление приводит к усилению секреции секФлA2(IIA) и окислению циркулирующих липопротеидов, изменение соотношения между концентрациями нативных и окисленных липопротеидов, а также сфингомиелина и окисленного фосфатидилхолина может влиять на развитие рестеноза коронарных артерий за счет изменения активности секФлA2(IIA). Полученные результаты могут быть использованы для поиска новых подходов в диагностике и лечении воспалительных процессов и сосудистых осложнений после транслюминальной коронарной ангиопластики у больных ИБС. Повышенные значения уровня и активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных после коронарной ангиопластики (по сравнению с этими значениями до проведения процедуры) могут быть использованы как прогностические параметры для выявления больных с повышенным риском развития рестеноза.

Внедрение в практику: Определение концентрации и активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови больных ИБС внедрено в практическую и научную деятельность Института клинической кардиологии имени А.Л.Мясникова РКНПК МЗ и СР РФ.

Апробация работы состоялась на межлабораторной научной конференции НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ и СЗ ЗФ» 25 июня 2009 г. Результаты работы доложены и обсуждены на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Симпозиум «Липопротеиды и атеросклероз» (С-Петербург, 21-23 ноября 1995 г); 7th Erfurt Conference on platelet (Германия, 28 июня-1 июля 1998); International Conference on Phospholipase A2 (Берлин, Германия, 26-29 мая 1999 г); XII International Symposium on Atherosсlerosis (Стокгольм, Швеция, 25-29 июня 2000 г); 5-я ежегодная сессия НЦССХ им. А.Н. Бакулева (Москва, 13-15 мая 2001); XIY International Symposium on drugs affecting lipid metabolism (Нью-Йорк, США, 9-12 сентября 2001 г); XI Congress of the Mediterranean league of angiology and vascular surgery (Чиос, Греция, 30 мая -2 июня 2001 г); III Всероссийский Национальный Конгресс кардиологов (Санкт-Петербург, 8-11 октября 2002); 6th International Symposium on global risk of coronary heart disease and stroke (Флоренция, Италия, 12-15 июня 2002 г); US-Russia Joint Simposium on the role of infections and inflammatory responses in the heart and lung (Орландо, Флорида, США, 6-8 ноября 2003 г); XII international symposium on atherosclerosis (Рим, Италия, 18-22 июня 2006 г); Форум «Кардиология 2006» (Москва, 2006 г); Конференция с международным участием, посвященная 90-летию академика Т.М. Турпаева (Москва, 24-26 ноября 2008 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликована 31 печатная работа: 18 в отечественных и 13 в международных изданиях.

Объём и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 9-ти глав, посвящённых собственным результатам и их обсуждению, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 210 страницах машинописного текста, содержит 34 рисунка и 8 таблиц. Список литературы включает 377 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Клиническая характеристика больных

В исследование были включены мужчины в возрасте от 38 до 69 лет (средний возраст 54,7 + 12,8) со стабильной стенокардией II-III функционального класса. Все пациенты имели ангиографически документированный стеноз как минимум одной магистральной коронарной артерии выраженностью > 70 %.

Всем пациентам была проведена транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика с имплантацией стента 316 L Bx Sonic, Cordis Corp., США (без лекарственного покрытия).

Все больные были сравнимы по возрасту, наследственно отягощённой гипертонии, перенесённому инфаркту миокарда, курению и основным биохимическим показателям крови и ангиографическим характеристикам поражения коронарного русла.

Из исследования исключались пациенты с острым инфарктом миокарда или перенесшие хирургические вмешательства в течение предшествующих 6 месяцев, больные с сахарным диабетом, острыми или хроническими воспалительными заболеваниями, онкологическими заболеваниями, гипергликимией, требующей медикаметозной коррекции, а также пациенты, у которых ангиопластика сопровождалась введением блокаторов IIb/IIIa рецепторов тромбоцитов.

При проведении коронарной ангиопластики каждому пациенту вводили 250 мкг нитроглицерина и 10 000 Ед гепарина внутриартериально с последующей внутривенной инфузией 1000 Ед/ч гепарина в течение 12 часов. После проведения процедуры пациенты получали тиклопидин 250 мг два раза в день в течение 1 месяца. В течение всего срока исследования пациенты принимали аспирин 100 мг в день. Всем больным после выписки из стационара были назначены статины. При наличии показаний пациентам назначали также нитраты, антогонисты кальция, ингибиторы АПФ.

Для выявления рестеноза через 6 месяцев после коронарной ангиопластики каждому пациенту была выполнена контрольная коронароангиография.

Клинико-инструментальные методы исследования

Транслюминальная баллонная коронарная ангиопластика (ТБКА) проводилась по стандартной методике. В устье пораженного сосуда селективно устанавливали катетер, к которому присоединялась закрытая система для контрастирования, промывания, инвазивной регистрации давления и инфузии лекарственных препаратов. В дистальный сегмент пораженного сосуда вводили коронарный проводник. Затем по проводнику к месту поражения проводили баллонный катетер, диаметр которого соответствовал должному диаметру стенозированного участка артерии. Центр баллона устанавливали в место максимального сужения артерии и выполняли предилятацию. Количество дилятаций стеноза составляло от 1 до 5. Каждая дилятация длилась от 30 до 90 сек, давление в баллонном катетере составляло от 2 до 16 атм. Затем баллонный катетер удаляли и по проводнику к поражённому сегменту проводили стент. Номинальный диаметр стента соответствовал должному диаметру артерии в стенозированном участке. Позиционирование стента производилось с котрольными снимками не менее чем в двух ортогональных проекциях. В последующем, при проведении коронарной ангиографии, съемка выполнялась в тех же проекциях. После установки стента производили ангиографический контроль не менее чем в двух ортогональных проекциях. Ангиографическим успехом считали результат, при котором остаточный стеноз после стентирования не превышал 10 %, отсутствовали признаки диссекции и тромбоза сосуда.

Коронарная ангиография проводилась на аппарате Coroscop-33 (Siemens, Германия) по стандартной методике. Съемка каждого стеноза производилась как минимум в 2-х ортогональных проекциях для его лучшей визуализации. Последующий анализ полученных ангиограмм проводилась с помощью системы компьютерного анализа Hicor (Siemens, Германия). Рестеноз диагностировался в случае сужения просвета сосуда в зоне проведенной ангиопластики > 50 %.

Биохимические методы исследования

Коллекция образцов крови. Образцы венозной крови отбирали из локтевой вены непосредственно перед коронарной ангиопласттикой (0 день), в течение первой недели и через 180 дней после процедуры. Для получения плазмы в пробирки для отбора крови добавляли антикоагулянт – 0,25М ЭДТА, рН 7,2 (2,5 мл на 100 мл крови), для получения сыворотки в пробирки ничего не добавляли. Отобранные образцы центрифугировали при 3000 об/мин в течение 20 мин при 40C и хранили при -70 0С до проведения анализа.

Получение цельной и делипидированной сывороток. Цельную сыворотку отделяли от венозной крови центрифугированием при 3000 rpm в течение 20 мин при 40C. Делипидированную сыворотку получали путем удаления из полученной цельной сыворотки всех классов липопротеидов методом последовательно ультрацентрифугирования. Перед экспериментом делипидированную сыворотку диализовали против 0.01 М PBS, рН 7.4 для удаления из нее NaBr. Для создания сравнимых условий цельную сыворотку также диализовали при идентичных условиях.

Методом электрофореза на ацетате целлюлозы на системе Scanion (Hospitex diagnostics S.A.) проверяли отсутствие липопротеидов и чистоту делипидированной сыворотки.

СекФлА2(IIA) из опухоли сердца человека (миксомы) была любезно предоставлена доктором Бибилашвили Р.Ш. и доктором Хаспековым Г.Л., (лаборатория генной инженерии Российского кардиологического научно-производственного комплекса). Удельная активность фермента составляла 36 мкмоль гидролизованного фосфатидилэтаноламина/мин/мг.

Липопротеиды выделяли из плазмы крови здоровых доноров путем последовательного градиентного ультрацентрифугирования по методу Havel [Havel et al., 1955].

Определении белка проводили по медоду, описанному Lowry [Lowry et al,. 1951]. Чувствительность метода была от 5 мкг до 35 мкг белка

Приготовление ЛНП, обогащённых СФМ, ФХ, ХС, ЭХС и окФХ. В отдельные пробирки добавляли различные количества СФМ, ФХ, ХС, ЭХС или окФХ, растворённых в хлороформе. Затем пробирки высушивали под струёй азота, добавили по 50 мкл 0,1 М PBS, рН 7.4 и озвучивали в течение 3-мин. К полученным суспензиям добавили свежевыделенные ЛНП (по 20 мкг белка в каждую пробирку) и инкубировали при 370С в течение 40 мин при постоянном перемешивании. Липопротеиды отделяли от неинкорпорировавшихся липидов центрифугированием смеси в плотности 1.006 г/мл в течение 8 час при 35000 оборотов/мин в роторе Type 65 фирмы «Бекман». Перед анализом липопротеиды диализовали против PBS, pH 7.4 и концентрацию белка в них определяли методом Лоури.

Приготовление окисленных липопротеидов. Свежевыделенные ЛОНП, ЛНП и ЛВП диализовали против PBS и хранили при 370С в течение 2-24 часов, либо через свежевыделенные липопротеиды пропускали струю кислорода в течение 40-90 мин. Окисление липопротеидов оценивали спектрофотометрически по образованию коньюгированных диенов при оптической длине волны 234 нм, как описано ранее [Esterbauer et al., 1989].

Тиобарбитуровый метод для определения липидных перекисей. 50 мкл образца смешивали со 150 мкл 20 % трихлоруксусной кислоты и со 150 мкл 0,67 % тиобарбитуровой кислоты. Инкубировали в течение 1 часа при 80 0С. После охлаждения при комнатной температуре смесь центрифугировали при 22000 g в течение 10 мин для осаждения денатурированного белка. Содержание продуктов окисления (TBARS – thiobarbituric acid reactive substances), выраженных как эквиваленты малонового диальдегида, определяли спектрофотометрически при 532 нм, используя в качестве стандаота 1,1,3,3-тетраэтоксипропан (или 1,1,3,3-тетраметоксипропан) (малондиальдегид бис-диметил ацетат).

Приготовление [14C]-меченных липопротеидов. 0.336 мкКю L-3-фосфатидилэтаноламин,1-ацил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФЭ) (59 мКю/ммоль, Амершам) растворяли в хлороформе, высушивали под струёй азота, добавили 50 мкл PBS и озвучивали (50 sec pulses) в соникаторе (модель 450, Branson Ultrasonic corp.). К полученной суспензии добавляли свежевыделенные ЛОНП (0,2 мг белка), ЛНП (0,5 мг белка) или ЛВП (0,5 мг белка) и инкубировали при 370С в течение 3 часов при постоянном перемешивании. Липопротеиды отделяли от неинкорпорировавшегося [14C]РЭ центрифугированием смеси в плотности 1.006 г/мл в течение 8 час при 35000 rpm в роторе Type 65 (Beckman Instruments, Mountain View, CA, USA). Супернатант, содержащий свободный радиомеченный ФЭ, удалили, а липопротеиды, находящиеся на дне пробирки, собрали. Количество инкорпорировавшегося [14C]ФЭ составило около 90%. Перед анализом липопротеиды диализовали против PBS, pH 7.4 и концентрацию белка в них определяли методом Лоури.

Приготовление [14C]-меченных липосом. Липосомы были приготовлены с использованием L-3-фосфатидилхолин,1-стеароил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФХ) (56 мКю/ммоль; Амершам) или L-3-фосфатидилэтаноламин,1-ацил-2-(1-14C)арахидонил ([14C]ФЭ) (59 мКю/ммоль, Амершам). Для приготовления липисом, содержащих радиоактивно меченный ФХ, [14C]ФХ (5 нмоль на каждую пробу) смешивали в хлороформе с холодным ФХ (12.5 нмоль на каждую пробу). Для приготовления липосом, содержащих радиоактивно меченный ФЭ, [14C]ФЭ (5 нмоль на пробу) смешивали в хлороформе с холодным ФХ (7.5 нмоль на пробу). Полученные смеси высушивали под струёй азота, затем растворяли в 1 мл диэтилового эфира и опять высушивали под струёй азота. Высушенные липиды ресуспендировали в соответствующем объеме Tris-HCl буфера pH 8.0, содержащего 100 мM Tris, 2 mM CaCl2, 0.15M NaCl, охлаждали в жидком азоте и озвучивали при 40С в соникаторе (модель 450, Branson Ultrasonic corp.) до получения четкой дисперсии. Для контрольных экспериментах готовили липосомы, содержащие только холодный ФХ (12,5 нмоль).

Определение концентрации секФлА2(IIA) в сыворотках крови проводили с помощью моноклональных антител, используя набор реактивов (sPLA2(IIA) (human synovial) enzyme immunoassay kit), полученный из Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, USA). Эти антитела специфичны для секФлА2(IIA) и не имеют перекрёста с типом I, типом IV, типом V, типом VI и типом Х секФлА2. Минимальная определяемая концентрация фермента составляла 15.6 пг/мл.

Определение активности секФлА2(IIA) в сыворотках крови больных после коронарной ангиопластики проводили с помощью [14C]ФХ, который содержался в липосомах и использовался в качестве субстрата. Инкубационная смесь содержала 20 мкл сыворотки, 5 нмоль радиоактивно меченного субстрата, 100 мМ Tris -HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2. Конечный объём реакционной смеси составлял 250 мкл. Реакции проводили в течение 30 мин при 37 0С при постоянном перемешивании и останавливали добавлением 1.5 мл хлороформ:метанола (2:1, объём\объём). Верхний водно-метанольный слой удаляли. Липиды, экстрагированные в нижний хлороформный слой, высушивали под струёй азота, растворяли в 80 мкл хлороформа и разделяли методом тонкослойной хроматографии на силикагельных пластинках (DC, Merk, Germany), используя сольвентную систему хлороформ : метанол : 28% NH4OH (60:30:8 об/об/об). Очищенный ЛФХ использовали в качестве стандарта в каждой хроматограмме. Липидные пятна визуализировали парами йода и фракции, соответствующие ЛФХ, выскребали во флаконы, содержащие 7 мл сцинтилляционной жидкости. Радиоактивность определяли жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Каталитическую активность определяли по количеству образовавшегося ЛФХ и выражали как нмоль/мин/мл.

Определение активности секФлА2(IIA) в цельной и делипидированной сыворотках здоровых доноров. Аликвоту сыворотки крови (либо цельной, либо делипидированной) с различным количеством секФлА2(IIA) добавляли к 10 мкл [14C]ФЭ-липосом, 100 mM Tris-HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2, 0.15M NaCl в конечный объём 500 мкл. В контрольном эксперименте в реакционную смесь, содержащую делипидированную сыворотку, добавляли только [14C]ФЭ-меченные липопротеиды без внесения [14C]ФЭ-липосом. Липиды разделяли методом тонкослойной хроматографии, используя сольвентную систему гексан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (85:15:1 об/об/об). Очищенную арахидоновую кислоту применяли в качестве стандарта в каждой хроматограмме. Радиоактивность определяли жидкостным сцинтилляционным счетчиком. Каталитическую активность оценивали по количеству гидролизованного ФЭ и выражали как пмоль/мин.

Ингибирование маноалидом и моноклональными антителами к секФЛА2(IIA) активности секФЛА2(IIA) в сыворотке крови пациентов. Образцы сыворотки крови пациентов, содержащие 2,75 нг/мл секФЛА2(IIA) и проявляющие секФЛА2-активность, инкубировали с различными количествами специфического ингибитора секФЛА2(IIA) маноалидом (0,1-0,5 мкМ) в течение 30 мин при 37 0С или с 0,1 и 0,2 мкг специфических моноклональных антител к секФЛА2(IIA) в течение 2-х часов при 37 0С, а затем определяли в них активность секФЛА2(IIA).

Влияние нативных и окисленных ЛОНП, ЛНП и ЛВП на активность секФлА2(IIA). Различные количества нативных или окисленных ЛОНП, ЛНП или ЛВП (10 - 80 мкг белка) инкубировали с очищенной секФлА2(IIA) или с секФлА2(IIA), содержащейся в делипидированной сыворотке. Для возможности сравнивать эффекты липопротеидов на активности обеих секФлА2 (IIA), ферменты брали в количествах, которые имели одинаковую активность и гидролизовали 30 пмоль ФЭ мин-1. Реакционная смесь содержала 10 мкл [14C]ФЭ-липосом, 100 mM Tris-HCl буфера pH 8.0, 2 мM CaCl2, 0.15M NaCl в конечном объеме 500 мкл. В контрольных экспериментах для определения возможности разбавления радиоактивно меченных [14C]ФЭ-липосом фосфатидилхолином, содержащимся в липопротеидах, в инкубационную смесь вместо липопротеидов добавляли липосомы, содержащие только ФХ. Экстракцию фосфолипидов и определение активность секФлА2(IIA) проводили, как описано в пункте «Определение активности секФлА2(IIA) в цельной и делипидированной сыворотках здоровых доноров». Активность выражали как процент гидролизованного ФЭ относительно контрольной пробы, которая инкубировалась в отсутствие липопротеидов.

Статистическую обработку результатов производили с применением прикладных программ “STATISTICA for WINDOWS 6.0” StatSoft Inc., США. Результаты представлены как средние значения (M) + стандартная ошибка среднего значения или стандартное отклонение среднего значения (SD). Пациенты без рестеноза выступали как «контроль» для группы пациентов с развившимся рестенозом. Достоверность изменения средних величин рассчитывали по t-критерию Стьюдента (после проведения анализа нормальности распределения статистических величин). При проведении корреляционного анализа между концентрацией и активностью секФлА2(IIA) вычисляли коэффициент линейной корреляции Пирсона. Для всех видов анализа статистически достоверным считали значения р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клинико-ангиографические показатели больных


загрузка...