Разработка и совершенствование биотехнологических процессов при промышленном производстве биопрепаратов (03.10.2011)

Автор: Попова Вера Михайловна

Культуры клеток. В экспериментах использовали первичные культуры клеток (ПКК) различного происхождения – почек крольчат (ПК), щенков (ПЩ), кошек (ПКШ), эмбрионов коров (ПЭК), фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) и перепелов (ФЭП); а также перевиваемые линии клеток: почки сирийского хомячка (ВНК-21), почки теленка (ПТ-80), почки крупного рогатого скота (MDBK), почки собаки (MDCK), почки свиньи (СПЭВ) (Ночевный В.Т., Башашкина Н.А., 1996-1999).

В качестве доноров были взяты: 1-4 - недельные крольчата, 1-2 - месячные щенки и котята, 3-9 - месячные эмбрионы коров, 6-10 - дневные перепелиные и 6-14 - дневные куриные эмбрионы.

Вирусы. Оценивали чувствительность тест-культур клеток к вирусам болезни Ауески (ВБА) штамма БУК-682, парагриппа -3 (ПГ-3) - штамма МВА 1/44, инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота – штамма МВА 1/80, энтерита собак (ПВЭС) – штамма С и Д, болезни Марека, вируса герпеса индеек (ВГИ) – штамма ФС-126, инфекционной бурсальной болезни (ИББ) птиц – штамма “Био-92”, чумы плотоядных - штамма (ЭЛМ). Работы проводилась совместно с ВГНКИ.

Staphylococсus aureus (St. aureus). Штамм золотистого стафилококка А-676 использовали для выделения протеина А (Государственный НИИ стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича).

Микрофильтрационные мембраны “Владипор”, изготовленные из ацетатацеллюлозы и регенерированной целлюлозы - МФА-А с размером пор 0,2-0,5 мкм, МФА-МА (0,2-0,5 мкм) и МФЦ (0,15; 0,2; 0,45 мкм), а также капроновые мембраны “Мифил” производства АН Белорусской ССР (г. Минск) и г. Таллин (5,0; 3,0 и 0,2 мкм), мембраны фирм “Millipor” и “Pall” (0,45 и 0,22 мкм и микропористые ядерные фильтры (от 0,03 до 8 мкм) использовали для очистки биологических жидкостей и растворов.

Ультрафильтрационные мембраны УАМ-50, 100, 150, 200, 300, 500 с диаметром пор - 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,03; 0,05 мкм (ацетат целлюлозы) и полупроницаемые мембраны в виде полых волокон типа ВПУ-5ПА, ВПУ-15ПА, ВПУ-50ПА, ВПУ-100ПА из полиамида с пределом задержания по белку 5, 15, 50, 100 кДа применяли для очистки и концентрирования биологически активных веществ.

Глубинные фильтры. При фильтровании биологических жидкостей применяли материалы на безасбестовой основе в виде пластин и картона: - фильтр-пластины - ФП (предварительной очистки), ФТ (тонкой очистки), ФC (стерилизующие), ФД (для удаления пирогенов) и картон КФМП и КФБЖ, разработанные по нашим техническим требованиям Марийским филиалом Волжского научно-исследовательского института целлюлозно-бумажной промышленности для медико-биологических целей (Канарский А.В., 2000).

Ионообменные мембраны. В работе применяли катионитовые мембраны МК-40 и анионитовые мембраны МА-41 из полиэтилена и ионитов.

Полимерные композиции. Сополимеры винилиденфторида и гексафторпропилена (фторкаучуки СКФ-26) и винилиденфторида и перфторметилвинилового эфира (СКФ-260) использовали для получения полимерных композиций и при иммобилизации трипсина; и кремнийорганические фторсилоксановые каучуки CКТФТ-100, CКТФТ-50.

2.1.2. Оборудование

Оборудование для культивирования клеток, вирусов, микроорганизмов и ферментов. Для получения первичных культур клеток и выращивания вирусов использовали роллерные аппараты. Монослойное культивирование клеток осуществляли на многотрубчатом культиваторе V=0,006 м3 в отделе вирусологии и культур клеток. Культивирование клеток и вирусов в суспензии и на микроносителях осуществляли в спиннере объемом 0,001 м3 и ферментерах (биореакторах) объемом 0,005; 0,025; 0,1; 0,25 м3, разработанных ГНУ ВНИТИБП и Иркутским НИИХМ, выполненных из нержавеющей стали, оснащенных магнитным приводом / Гуславский А.И./, датчиками температуры, рН, еН, рО2 /Рубан Е.А., Раевский А.А., Абрамов А.Б., Потемкин А.А./.

В технологической обвязке использовали запорную, запорно-регулирующую арматуру (малогабаритные вентили сильфонные проходные МВСП и угловые вентили МВСУ, разработанные ЦКБарматуростроения; электроисполнительные механизмы ЭИМ и запорные клапаны с электромагнитным приводом ПТ 26525, разработанные ВНИИэлектропривод и ЦКБарматуры по технико-экономическим требованиям ГНУ ВНИТИБП и изготовленные ПО ”Пензтяжпромарматура“). Для очистки, стерилизации и обезвреживания отработанных газов использовали фильтры предварительной и тонкой очистки с фильтроэлементами диаметром 46; 75; 90; 120 мм из фторопласта – 4 и титана (с диаметром пор 12-20 мкм и 2-6 мкм).

Глубинное культивирование штамма St. aureus, применяемого для выделения протеина А, проводили в лабораторном биореакторе АК-210 (объемом 0,01м3), с автоматическим контролем и регулированием температуры, скорости перемешивания, аэрации, рН.

При получении трипсина использовали следующее оборудование: электромясорубку МП, эмалированные и нержавеющие реакторы (объемом 0,060-1,0м3), нутч-фильтры, центрифуги (осадительно-фильтрующие ОФСст 0,1 и 0,2 м3/час; суперцентрифугу ОТР-101К; шнековую ОГШ), саморазгружающиеся и камерные сепараторы. Сушку фермента проводили на распылительных установках РСЦ 1,2/09 БК РСЦ-10 и “Минор” фирмы “Ниро-Атомайзер” и сублимационных - ТГ-15, ТГ-50.

Оборудование для фильтрования и разделения. Для тонкого и стерилизующего фильтрования водных растворов, биологических жидкостей, питательных сред, ферментных растворов с помощью мембранных фильтров использовали фильтродержатели диаметром 90, 142, 293 мм и мультиплетную установку УСФ-0,28/7. Мембранное разделение различных растворов осуществляли на фильтрационных ячейках ФМ-02 объемом 10, 200, 1000 мл с магнитной мешалкой, тонкоканальной установке ФТ-01, опытной ультрафильтрационной установке “фильтр-пресс” УФ-5, и ультрафильтрационных разделительных модулях на полых волокнах фирмы Мем-Текс (РФ г. Мытищи): УВА-2-5ПА, УВА-2-15ПА, УВА-2-50ПА, УВА-2-100ПА и модифицированной установке УФУ с центробежным насосом марки ЦНГ-0,5/10. Электродиализатор типа ЭК-04-74 с ионообменными мембранами (катионитовыми МК-40 и анионитовыми МА-41) использовали при обессоливании альбумина в производственных условиях. При электродиализе происходит перенос ионов из одного раствора в другой через ионообменные мембраны. Движущей силой процесса является внешнее электрическое поле. Катионы двигаются к катоду, а анионы к аноду. Постоянный ток, проходящий через раствор, устанавливается в зависимости от природы растворенных веществ, их концентрации и подведенного напряжения.

Для разделения культуральных жидкостей, выделения клеток, вирусов, ферментов, сбора осадка, белка из надосадочной жидкости, осветления суспензий применяли различные центрифуги и сепараторы: S-23, S-24, S-70; ОФСст- 0,1; ОФСст- 0,2; ОТР-101К; сепаратор Ж5-АСГ-3М (Гуславский А.И.).

2.1.3. Методы

Методы культивирования клеток и вирусов. Пролиферативную активность клеточных культур оценивали с помощью индекса пролиферации. Концентрацию клеток определяли путем их подсчета в камере Горяева. Жизнеспособность клеток в суспензии выражали в процентом соотношении к общему количеству клеток. Титр вируса ВГИ определяли по количеству фокусообразующих единиц в 1 см3, титр вируса ИББ по методу Кербера (1931) в модификации Ашмарина И.П. (1959).

Методы контроля фермента. Физико-химические свойства трипсина определяли по ГОСТ 202642-89. Наличие фермента в суспензии осуществляли экспресс-методом на фотопленке; протеолитическую активность - по РСТ ЛССР 424-84 ТУ ОКП 921.828.1500 и ТУ 9358.013.00008064-96 - по Шоу-Петиколас. Диспергирующие свойства трипсина на тест-культуре клеток ФЭК оценивали по выходу клеток из 1 г, жизнеспособности, адгезивным и ростовым свойствам (урожаю, УК и индексу пролиферации, ИП).

Физико-механические свойства полимерных композиций. Свойства полимерных вулканизатов в исходном состоянии и после теплового старения определяли по ГОСТ 9024-74 и ГОСТ 9.029-74.

Статистическая обработка результатов. При статистической обработке экспериментальных результатов использовали метод регрессивного анализа. Достоверность результатов оценивали по критерию Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1980). Результаты считали достоверными при Р < 0,05.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Производство биопрепаратов представляет собой комплекс взаимосвязанных биотехнологических процессов: приготовление компонентов среды и ее изготовление, получение фермента и его раствора для дезагрегации культур тканей; культивирование (клеток, вирусов и бактерий); выделение и очистка биологических растворов, питательных сред и растворов; сушка биопрепаратов. В связи с этим рассматривались вопросы получения отечественного ферментного препарата трипсина для вирусологических целей, процессы культивирования клеток при получении вирусных вакцин, осуществления крупномасштабного культивирования в стерильных условиях; получения бактерийной массы для получения протеина А, разработки мембранных способов очистки, разделения, концентрирования и стерилизации при использовании отечественного оборудования и материалов.

2.2.1. Усовершенствование технологии получения

фермента трипсина

2.2.1. 1. Разработка технологических процессов изготовления трипсина

В производстве противовирусных вакцин для дезинтеграции клеток используется протеолитический фермент трипсин, в основном импортного производства. Нами проведены исследования по разработке технологии получения фермента отечественного производства. Для этого необходимо было решить комплекс задач, таких как выделение, разделение и очистка фермента, его консервация, оценка физико-химических и биологических свойств. В качестве исходного сырья при получении фермента использовали поджелудочную железу (ПЖ) крупного рогатого скота (КРС), свиньи и птиц. ПЖ КРС была наиболее технологична. Исходное сырье использовали после 4-12 месяцев хранения, обеспечивающее активацию профермента трипсина. Двукратное замораживание, оттаивание и последующее измельчение ПЖ до частиц размером 8 мм, разрушающие клеточные оболочки ткани, исключали образование устойчивой суспензии и способствовали полному выделению фермента из исходного сырья и увеличению активности препарата на 40 ЕД (22-27%) по сравнению с сильно измельченной железой ( до частиц 2 мм). Максимальную активность фермента получали через 6 час экстрагирования и 12 час отстоя на первой стадии и в течение 2-3 час экстрагирования на второй стадии. Перемешивание суспензии в процессе экстрагирования проводили в автоматическом режиме (3 мин – перемешивание, 7 мин - простой), обеспечивающее незначительное пенообразование и исключающее получение устойчивой суспензии. Экстрагирование фермента проводили при температуре не выше 16оС, так как при более высокой температуре наблюдается инактивация и самопереваривание трипсина. Снижение температуры суспензии до 7+2 оС позволило получить препарат с максимально высокой активностью. РН на 1 этапе экстрагирования составлял 3,1 - 3,35, а на 2 этапе - 1,7 - 2,0. При осаждении балластных веществ в течение 6 час выход составил 9,5% от объединенного экстракта и 30% от исходного сырья. Выход балластных веществ в сухом виде составил 11% от его общей массы и 2,3% от исходного сырья. После 12-18 час второго этапа высаливания выход трипсина по отношению к фильтрату после удаления балластных веществ составил 2-2,5%. Процент выхода трипсина от исходного сырья колебался от 2,5% до 6%. В сухом виде выход фермента составил 60-80% от осажденного субстрата и 2,5-3,5% от массы исходного сырья.

Проведенные исследования позволили рекомендовать для разделения суспензии после экстрагирования следующее оборудование с учетом массы исходного сырья: до 70 кг - центрифуги ОФСст; от 70 до 100 кг – центрифуги Рапид, ОФСст, от 100 и более - шнековую центрифугу ОГШ отдельно или совместно с центрифугой ОФСст для последующего осветления фильтрата. При разделении суспензии после высаливания балластных веществ и трипсина использовали следующее оборудование: 20-50 кг - центрифугу ОФСст, 20-100 кг - суперцентрифугу ОТР-101К, более 100 кг - сепараторы для отделения балластных веществ и трипсина, и суперцентрифугу для извлечения трипсина после осаждения. Протеолитическая активность препарата после разделения суспензии с помощью центрифуг была на 20-40% выше, чем при использовании обычного фильтрования, при этом снизились потери, и улучшилось качество готового препарата. Кроме того, в 2-3 раза уменьшились затраты рабочего времени и количество обслуживающего персонала.

Остаточное содержание солей в высоле трипсина составляло 30-50%, удаление которых проводили с помощью ультрафильтрационных установок на полых полупроницаемых волокнах из полиамида при диафильтрации, что позволило в 6-7 раз снизить количество сульфата аммония до 3-5 %, при необходимости до полного обессоливания.

В связи с термолабильностью ферментного препарата изучали возможные способы его консервации при использовании различных методов высушивания и влияние их на ферментативную активность трипсина (табл.1).

Таблица 1

Сравнительная оценка влияния методов высушивания на

ферментативную активность трипсина

высушивания Температура

высушивания, 0С Время

сушки,

ч Характеристика препарата

на входе на выходе

Массовая доля влаги,% Активность, ЕД

Распылительный 130-140 60-75 2 1,56+0,37 443+28,6


загрузка...