Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность (02.08.2010)

Автор: Киль Владимир Ильич

С.Петер-

бург 0.0029 0.0144 0.0013 ****** 0.9943 0.9991

Краснодар 0.0059 0.0109 0.0049 0.0057 ****** 0.9949

Ейск 0.0034 0.0186 0.0000 0.0009 0.0052 ******

генетическая идентичность (над диагональю) и генетические расстояния (под диагональю)

Можно заметить, что наиболее близки в генетическом отношении оказались выборки из Ейска и Ставрополя (генетическая идентичность по Nei = 1,0), что, вероятно, указывает на принадлежность этих выборок к одной популяции. Это также наглядно демонстрируют данные кластерного анализа (рисунок 4), где обе эти выборки входили в один кластер.

Наиболее близкой к ним с генетических позиций, несмотря на географическую удаленность, была выборка C.pomonella из Санкт-Петербурга, а наиболее удаленной от них в генетическом отношении была выборка насекомых из Мелитополя.

Таким образом, описана молекулярно-генетическая структура ряда популяций яблонной плодожорки из России и Украины по микросателлитным локусам. Обнаружены значительные отличия в молекулярно-генетической структуре между популяциями как по числу аллелей на локус, степени гетерозиготности, так и по внутрипопуляционному генетическому разнообразию. Данные различия, вероятно, связаны не только с географическим положением, но и с пестицидным прессом, которому подвергались популяции насекомых. Определены

Рисунок 4 - Дендрограмма по Nei's (1978).

Генетические расстояния: метод UPGMA

коэффициенты генетического сходства и генетические расстояния между исследуемыми выборками насекомых. Снижение гетерогенности отдельных популяций, по-нашему мнению, может быть связано с большим количеством пестицидных обработок в этих садах.

Глава 5. ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей

к инсектицидам

Исследование насекомых-вредителей молекулярно-генетическими методами позволяет изучать механизмы изменчивости структуры популяций под влиянием стрессовых факторов внешней среды, в том числе инсектицидов, а также приблизить нас к пониманию механизмов развития резистентности к инсектицидам непосредственно на генетическом уровне. В данной главе диссертации представлены результаты оценки влияния инсектицидов и условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки и клопа вредная черепашка.

Проблема поиска ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам по сути связана с проблемой идентификации генотипов (в нашем случае резистентных насекомых) по фенотипу (RAPD-фенотипу). Попытки идентификации резистентных к инсектицидам генотипов методом RAPD-PCR были предприняты для разных видов насекомых [Cидоренко и др., 2000; Баринов и др., 2005; Guerrero et al, 1997].

Для молекулярно-генетического анализа исследуемой популяции насекомых прежде всего необходимо иметь две группы особей, близких в генетическом отношении, но различающихся по признаку «резистентность к инсектициду». При этом выбор исходного материала для поиска молекулярных (ДНК) маркеров резистентности к инсектицидам базируется на отборе резистентных генотипов в ходе лабораторной селекции в ряду нескольких поколений поливольтинных видов насекомых при постоянном воздействии селектирующего фактора (инсектицида).

В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год или в несколько лет, использование такого подхода не представляется возможным, поскольку получение резистентных генотипов в лаборатории предполагает посемейный отбор в ряду как минимум 10-20 поколений, что, в свою очередь, требует многолетней работы. При этом исходные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Кроме того, при доминантном характере наследования признака гетерозиготные самки (самцы) при скрещивании будут снова давать расщепление по данному признаку.

В этой связи нами был использован новый подход к отбору резистентных к инсектицидам генотипов. Он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких генераций, процесса селекции и постоянного посемейного отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход заключается в том, что выборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают динамику смертности насекомых, отбирая при этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, или оставшихся в живых, в зависимости от используемой концентрации инсектицида (устойчивые). При этом количество отобранных особей должно быть не более 10% от объема выборки. Кроме того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в постоянном взаимодействии с инсектицидами и иметь высокий показатель (уровень) резистентности, что априори предполагает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции моновольтинного вида - клопа вредная черепашка E. integriceps.

С использованием имеющегося у нас набора RAPD-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по восьми из них найдены отличия между двумя группами насекомых, а наиболее характерные – по двум ДНК-фрагментам (рисунок 5).

Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высокой частотой встречаемости ДНК-маркера OPA18/520, а также наличием маркеров OPA07/410 и OPA06/470 при отсутствии таковых у чувствительных особей. В свою очередь для чувствительных особей было характерно 100%-ное присутствие маркера OPA06/430 при практическом отсутствии его у устойчивых особей и более высокая частота встречаемости маркеров OPA18/400, OPA07/470, OPA07/450. Наиболее характерные различия между двумя выборками наблюдали по праймеру OPA06 (RAPD-маркеры 470 и 430 п. н.).

Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в данном случае присутствием двух главных RAPD-локусов, по которым отличались конкретные генотипы. Присутствие одного из маркеров, как правило, сопровождается отсутствием другого, что, вероятно, указывает на существование определенной взаимосвязи между маркируемыми локусами. Более того, вполне вероятно, что исследуемый признак контролируется большим числом генов и маркируется соответственно большим числом ДНК-

Рисунок 5 – RAPD-фенотипы клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58 (праймер ОРА06). Дорожки: 1-8 – чувствительные особи; 9-17–устойчивые особи. М – Маркеры молекулярных масс (Pst1)

фрагментов. В целом влияние инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было весьма существенным. Оценка по наиболее значимым RAPD-маркерам между двумя исследуемыми выборками насекомых (чувствительные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства между ними был незначителен и составил 0,61 (по Nei, 1978). Важно отметить также, что наблюдаемое генетическое разнообразие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это вполне объяснимо, так как действие инсектицида ведет к элиминации чувствительных особей, а, следовательно, и к снижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой в частности по отдельным ДНК-локусам.

Таким образом, влияние инсектицида Би-58 Новый на клопов вредной черепашки сопровождается изменениями в молекулярно-генетической структуре и снижением генетического разнообразия популяции. Поиск ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, постоянно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода. RAPD-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная черепашка и выявить резистентные к инсектицидам генотипы.

В то же время из-за низкой воспроизводимости RAPD-маркеров к их использованию для целей мониторинга резистентности необходимо подходить с осторожностью. Чтобы избежать ошибки опыта эксперименты необходимо ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором реактивов, на одном амплификаторе, в одной ПЦР. Кроме того, для большей репрезентативности необходимо последующее

Таблица 9 – Генетическое разнообразие и частота встречаемости отдельных RAPD-локусов в выборках клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58

RAPD-локус Чувствительные Устойчивые

ОРА18/520 0.25 0,50

OPA18/450 0,50 0,06

OPA07/470 0,25 0,10

OPA07/450 0,21 0,06

OPA07/430 0,29 0

OPA07/410 0 0,34

OPA06/470 0 1,0

OPA06/430 1,0 0,03

Генетическое разнообразие по Nei (h ± ?) 0,25 ± 0,21 0,17 ± 0,19*

Индекс Шеннона (I ± ?) 0,37 ± 0,31 0,28 ± 0,26

*- tфакт.?t05 - достоверно отличаются от чувствительных

преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи

полученные данные носят лишь предварительный характер, в то же время это не снижает значимости самого подхода. В конечном итоге результаты подобных экспериментов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и помогут лучше понять механизмы формирования этого процесса.


загрузка...