Молекулярно-генетические механизмы врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек при патологии инфекционного генеза (02.08.2010)

Автор: Ганковская Оксана Анатольевна

6. Определить диагностическую значимость выявленных изменений уровней экспрессии генов TLRs, противомикробного пептида HBD-1 в клетках слизистой оболочки урогенитального тракта и продукции цитокинов у больных хроническим простатитом.

7. Изучить роль сигнального рецептора TLR9 и противомикробного пептида (-дефенсина 2 в эпителиальных клетках роговицы в развитии герпетического кератита.

8. Обосновать комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек, основанный на 1) изучении полиморфизма генов TLR и противомикробных пептидов, 2) определении уровня их экспрессии и 3) функциональной активности для выявления маркеров течения инфекционного процесса.

Научная новизна

- Впервые представлен комплексный подход к оценке функционирования системы Toll-подобных рецепторов, основанный на изучении: экспрессии генов TLRs, транскрипционных факторов, эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.).

- Впервые показано, что гиперэкспрессия TLR2 в эпителиальных клетках цервикального канала беременных женщин с урогенитальной инфекцией, сопровождающаяся повышенной продукцией ИЛ-8, ИФН( и сниженной экспрессией HBD-1, приводит к реализации внутриутробного инфицирования плода и к преждевременным родам. Выявлены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода при урогенитальной инфекции, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и HNP-1-3 в сыворотке периферической крови.

- Впервые в клетках плаценты при преждевременных родах выявлен дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP, который заключается в повышении уровня экспрессии генов каспаз, коррелирующих с увеличенной экспрессией генов TLRs и со сниженной экспрессией генов ингибиторов каспаз.

- Впервые исследована ассоциация полиморфных маркеров Arg677Trp и Arg753Gln в гене TLR2, Asp299Gly и Thr399Ile в гене TLR4, 2848G/A в гене TLR9, G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A в гене DEFB1 с урогенитальной инфекцией у беременных, преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода. Показана ассоциация аллеля A(-20) и генотипа GG (-52) гена DEFB1 с увеличением уровня экспрессии (-дефенсина 1 в эпителиальных клетках цервикального канала при выше указанной патологии.

- Впервые определены прогностические критерии иммунодефицитного состояния при хроническом простатите на основе данных о снижении уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбалансе про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

- Впервые изучены показатели системы врожденного иммунитета в конъюнктиве и роговице глаза у детей - уровень экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2, обеспечивающего противовирусную и антибактериальную защиту тканей глаза. Установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом и оказывает положительный терапевтический эффект.

- Получены новые данные по межлинейным различиям в развитии вирусного кератита и экспрессии гена TLR9 в роговице мышей линий С57BL/6 и BALB/с.

- На клетках Vero изучена экспрессия генов TLR1, TLR2, TLR4, TLR9 и др. и определена функциональная активность клеток по выработке цитокинов в ответ на воздействие различных патогенов (вируса простого герпеса (ВПГ), C.albicans и др.).

Практическая значимость

Разработаны и внедрены в клиническую практику системы на основе ПЦР-РВ для определения экспрессии генов TLRs, цитокинов и противомикробных пептидов в качестве прогностических и диагностических критериев у женщин с преждевременными родами, реализацией внутриутробного инфицирования плода, а также у пациентов с хроническим простатитом и герпетическим кератитом.

С использованием разработанных систем определены маркеры риска развития преждевременных родов, внутриутробного инфицирования плода. Комплекс маркеров на основе исследования экспрессии генов TLRs, дефенсинов, продукции противомикробных пептидов и цитокинов в цервикальном канале женщин, позволяет с большей долей вероятности прогнозировать преждевременные роды и развитие внутриутробного инфицирования плода. При гиперэкспрессии TLR2 более, чем в 5 раз и снижении экспрессии HBD-1 (в 2,5 раза и более) в 70% случаев наблюдаются преждевременные роды.

Определена панель полиморфных маркеров генов-кандидатов (TLR2, TLR9 DEFB-1) реализации внутриутробного инфицирования плода, преждевременных родов, что позволяет оценить риск развития патологического процесса во время беременности.

Разработаны экспериментальные системы оценки экспрессии генов и эффекторных молекул в культурах клеток (Vero, HeLa), что позволяет исследовать действие препаратов на компоненты врожденного иммунитета.

Внедрен новый метод лабораторной диагностики определения уровня экспрессии гена сигнального рецептора TLR9 в эпителиальных клетках роговицы и конъюнктивы при герпетическом древовидном кератите у детей. Обосновано применение препарата Суперлимф в комплексной терапии герпетических кератитов у детей, позволяющей снизить уровень осложнений и добиться нормализации экспрессии TLR9.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны системы для определения экспрессии генов молекул врожденного иммунитета Toll-подобных рецепторов (TLR1, TLR2, TLR4, TLR6, TLR9), противомикробных пептидов (HNP-1, HBD-1, HBD-2), цитокина (ФНО() и других молекул (NF-kB, каспазы 3, каспазы 8, ингибиторов каспаз FLIP и XIAP) и апробированы в моделях инфекционного процесса in vitro и in vivo.

2. С использованием разработанных систем определены новые маркеры ранней диагностики неразвивающейся беременности, преждевременных родов при урогенитальной инфекции, внутриутробного инфицирования плода, основанные на оценке уровня экспрессии генов TLR2, HBD-1 в эпителиальных клетках цервикального канала и на ассоциации полиморфных маркеров генов, белковые продукты которых участвуют в реакциях врожденного иммунитета. Разработана концепция развития преждевременных родов, заключающаяся в гиперактивации TLR2-опосредованного апоптоза клеток плаценты. При преждевременных родах в клетках плаценты наблюдается дисбаланс в экспрессии генов каспазы 3, каспазы 8 и ингибиторов апоптоза FLIP и XIAP.

3. Развитие хронического простатита сопровождается снижением уровня экспрессии TLR2 в эпителиальных клетках уретры и дисбаланс про- и противовоспалительных цитокинов в секрете простаты.

4. При изучении уровня экспрессии распознающего рецептора TLR9 и противомикробного пептида HBD-2 в клетках конъюнктивы и роговицы глаза у детей, установлено, что комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) приводит к нормализации экспрессии гена TLR9 в эпителиальных клетках роговицы глаза детей с древовидным герпетическим кератитом, а также снижает частоту осложнений при указанной патологии.

5. Разработан комплексный подход к оценке TLR-опосредованных механизмов врожденного иммунитета, основанный на изучении экспрессии генов TLR (при действии различных лигандов); сигнальных молекул и транскрипционных факторов; эффекторных молекул (цитокинов, противомикробных пептидов и др.). Анализ компонентов TLR-системы проведен на уровне полиморфизма генов, экспрессии мРНК, секреции эффекторных молекул.

Внедрение результатов работы

Результаты исследований, представленных в диссертационной работе, внедрены в учебный процесс студентов, ординаторов и аспирантов, а также курс лекций по повышению квалификации врачей в Российской медицинской академии последипломного образования, Смоленской Государственной Медицинской Академии и Медицинском институте Орловского государственного университета.

Применение исследования экспрессии генов TLRs представлено в Патенте на изобретение №2334233: «Способ прогнозирования преждевременных родов при урогенитальной инфекции». Официальный Бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам РФ №17 «Изобретения. Полезные модели» 20.09.2008 г.

Получено положительное решение о выдачи патента на изобретение (Заявка №2009108294/15(011092), дата подачи заявки 10.03.2009 г.).

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы доложены на заседании Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (2009), Всероссийском научном Форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург 2004, 2006, 2007, 2009), Республиканской научной конференции «Иммунология репродукции» (Иваново, 2005), Международной пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2005, 2007, 2010), Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва 2005, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010), Российской научно-практической конференции «Современные технологии в иммунологии: иммунодиагностика и иммунотерапия» (Курск, 2006), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006), V конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической аллергологии и иммунологии» (Оренбург, 2006), Четвертом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007), 6-th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling (Poland, Krakow, 2007), Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н.И.Вавилова (Киев, 2007), 8-th John Humphrey advanced summer school in immunology: Immunology and Viral Infection (Москва, 2007), VI конференции иммунологов Урала (Ижевск, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), XXVII Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Barcelona, Spain 2008), 6-th European Congress of Reproductive Immunology (Москва, 2008), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), X Международном Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо (Казань, 2009), Съезде офтальмологов России (Москва, 2009), GA2LEN/EAACI Summer Allergy School (Great Britain, Norwich, 2009), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Great Britain, London, 2010).

Апробация диссертации состоялась ___ мая 2010 года на заседании Ученого совета НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Публикации

По теме диссертационной работы опубликовано в 68 печатных работы, в том числе 19 в изданиях, рекомендованных ВАК, материалы включены в монографию «Невынашивание беременности, инфекция, врожденный иммунитет» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». – 2007 и методическое пособие «Иммунология. Практикум.» // М. :«ГЭОТАР-Медиа». - 2010.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 392 источника, из которых 105 отечественных и 287 зарубежных. Работа выполнена на 300 страницах машинописного текста, иллюстрирована 50 рисунками и 51 таблицей.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Материалы

В работе использованы штаммы ВПГ-1 (VR-3) и ВПГ-2 (MS), полученные из Национальной вирусной коллекции (Великобритания). До начала экспериментов вирусы прошли 5-7 последовательных пассажей на культуре клеток Vero. Инактивированные образцы Candida albicans (АТСС 885-653) любезно предоставлены профессором Л.П. Блинковой (ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН).

Для стимуляции мононуклеарных клеток и нейтрофилов использованы антигены ВПГ [Королюк М.А., 2002] и лизат Candida albicans, а также липополисахарид (ЛПС) (Sigma, США), комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов - препарат Суперлимф («Центр иммунотерапии «Иммунохелп», РФ).


загрузка...