Оксидативный стресс и система оксида азота при постнатальной адаптации и развитии заболеваний у сельскохозяйственных животных (02.08.2010)

Автор: Близнецова Галина Николаевна

Практическая значимость. Изучение характера течения процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, функционирования антиоксидантной системы и системы оксида азота позволяют углубить и систематизировать современные представления о значении нитрозотивного и оксидативного стресса в развитии патологий разного генеза. Результаты исследования особенностей этих процессов в условиях модуляции образования оксида азота в организме, как в норме, так и патологии позволят предложить новые подходы в разработке способов и методов прогнозирования исхода, профилактики и лечения заболеваний сельскохозяйственных животных разной этиологии.

На основании проведенных исследований разработаны и утверждены на федеральном уровне: Методические рекомендации по оценке и коррекции иммунного статуса животных (Воронеж, 2005); Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению стабильных метаболитов оксида азота в плазме (сыворотке) крови (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по определению субклеточной генерации супероксиданиона в тканях (М.: РАСХН, 2007); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и лечению омфалита у новорожденных телят (Воронеж, 2008); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гепатопатий у крупного рогатого скота (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по диагностике, профилактике и терапии гестоза у молочных коров и свиноматок (Воронеж, 2009); Методические рекомендации по оптимизации формирования колострального иммунитета у новорожденных животных (Воронеж, 2009).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на Международных научно-практических конференциях «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 2002); «Свободные радикалы, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2003); III съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); «Свободные радикалы, антиоксиданты и здоровье животных» (Воронеж, 2004); XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); «Актуальные проблемы болезней органов размножения и молочной железы у животных» (Воронеж, 2005); «Актуальные проблемы патологии, фармакологии и терапии» (Воронеж, 2006); ( съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Воронеж, 2007); Международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области (Курск, 2008); «Трансферт инновационных технологий в животноводстве» (Орел, 2008); «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях» (Воронеж, 2008); (( съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов России (Казань, 2009).

Публикации. Основные научные результаты, включенные в диссертацию, опубликованы в 57 печатных работах, в том числе в 26 статьях в ведущих научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 8 методических рекомендациях, 1 методическом пособии и 4 патентах.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Видовые и возрастные особенности функционирования антиоксидантной и NO(- L-аргинин систем.

2. Роль оксидативного стресса и системы оксида азота в постнатальной адаптации животных.

3. Характер свободнорадикального окисления и состояние ситемы NO(- L-аргинин при различных патологиях сельскохозяйственных животных.

4. Влияние модуляции продукции оксида азота на интенсивность пероксидного окисления липидов и белков, состояние АОС и образование NO( и S-нитрозотиолов.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 285 страницах и включает введение, обзор литературы, материал, объем и методы исследований, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, предложения и список литературы. Диссертационная работа проиллюстрирована 49 таблицами и 41 рисунками. Список литературы включает 449 источников, в том числе 298 иностранных авторов.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 2005-2010 г.г. в отделе патобиохимии и патофизиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии РАСХН в соответствии с планом научно-исследовательских работ по заданиям 04.01.01 “Изучить на молекулярно-биохимическом, структурно-функциональном, системно-физиологи-ческом и экологическом уровнях и определить причины и механизмы перехода организма из нормального состояния в патологическое и на этой основе разработать средства, методы и технологии защиты здоровья и продуктивности животных” (№ гос. регистрации 01.200.117018) и 08.04.01 «Разработать методы ранней диагностики, эффективные средства и способы профилактики и лечения массовых незаразных и вызываемых условно-патогенными микроорганизмами заболеваний у молодняка высокопродуктивных животных» (№ гос. регистрации 15070.3666026906.06.8.001.2).

В проведении ряда исследований принимали участие сотрудники и аспиранты ВНИВИ патологии, фармакологии и терапии А.Г. Нежданов, С.М. Сулейманов, А.И. Золотарев, Ю.Н. Масьянов, В.И. Шушлебин, Т.Г. Ермолова, Н.Н. Каверин, С.С. Артемьева, Н.В. Пасько, А.Е. Черницкий, Д.Б. Чусов и другие, а так же сотрудник института геохимии и аналитической химии им. В.И.Вернадского В.А.Сафонов, которым автор выражает искреннюю признательность за оказанную помощь и плодотворное сотрудничество.

В проведении экспериментальных и научно-производственных работ использовали: самцов белых беспородных крыс с массой тела 200,0±25,0 г (n=274); откормочных быков (n=18), коров (n=209) и телят красно-пестрой и симментальской породы (n=250); ягнят (n=25), поросят (n=30) и кровь новорожденных детей (n=14). Подробнее схемы проведения опытов и дозировки используемых веществ представлены в соответствующих разделах диссертации.

Токсическое повреждение печени у крыс вызывали путем двукратного внутрибрюшинного введения, один раз в сутки тетрахлорметана (CCl4) в виде 40% раствора в оливковом масле в дозе 0,2 мл/100 г массы тела. Исследования проводили через сутки после второго введения CCl4. О степени повреждения печеночной паренхимы судили по изменению активности в сыворотке крови маркерных ферментов: аланинаминотрансферазы (АлАт) и аспартатаминотрансферазы (АсАт).

Эмоционально-болевой стресс моделировали путём иммобилизации крыс на спине с жесткой фиксацией конечностей в течение 18 часов. В качестве контроля использовали животных, не подвергавшихся иммобилизации, но лишенных воды и пищи в течение 18 часов.

До экстремального воздействия и после иммобилизации животных взвешивали. Затем с соблюдением существующих норм отделяли и взвешивали надпочечники, тимус, селезенку, вычисляли относительную массу органов (мг/100 г массы тела животного). Для оценки стрессогенного ульцерогенеза желудок промывали, просматривали и подсчитывали в нём количество язв, измеряли их длину.

Нанесение ожоговой травмы у крыс осуществляли под хлороформным ингаляционным наркозом. Два дозированных симметричных ожога IIIA степени площадью по 300 мм2 наносили на обе стороны предварительно выбритой заднебоковой части тела с помощью специального приспособления при t =100(С в течении 10 секунд. Общая площадь ожогов при этом составляла около 5% поверхности тела.

Кровь для проведения биохимических исследований у всех лабораторных животных получали под наркозом из сердца. В качестве антикоагулянта использовали ЭДТА-Na2 . Для получения гомогената печени ткань гомогенизировали в 0,05 М трис-буфере рН 7,4 в соотношении вес/объем 1:5.

При модуляции продукции оксида азота в качестве эндогенного индуктора синтеза использовали L-аргинин (L-Arg), который вводили животным в дозе 400 мг/кг внутрибрюшинно. Блокаторы синтеза NO( аминогуанидин (AG) и метиловый эфир нитро-L-аргинина (L-NAME) вводили животным в одинаковой дозе 50 мг/кг внутрибрюшинно. Животным контрольных групп вводили либо дистиллированную воду, либо 0,9% раствор хлорида натрия. Более подробные схемы применения модуляторов продукции NO(, представлены в соответствующих разделах.

При изучении влияния соединения ФБ-26 – нитроксисукцинат 2-этил-6-метил-3-оксипиридина – на оксидантно-антиоксидантный статус и систему оксида азота, раствор исследуемого соединения вводили внутрибрюшинно в дозах 20 и 100 мг/кг массы тела при иммобилизационном стрессе и в дозе 100 мг/кг массы тела при токсическом повреждении печени тетрахлорметаном и ожоговой травме.

Содержание в сыворотке крови глюкозы, холестерина, креатинина, мочевины, кальция, неорганического фосфора, активность (-глутамилтранс-феразы ((-ГТ), аспартат- (АсАТ) и аланинтрансферазы (АлАТ), щелочной фосфатазы (ЩФ) определяли на биохимическом анализаторе «Hitachi-902» (Япония). В ряде опытов активность (-ГТ, АлАТ и АсАТ, содержание (-липопротеидов, показатель сулемовой пробы, общие липиды определяли с помощью наборов фирм «Vital Diagnostic» (Россия), «Lachema» (Чехия) и KONE (Финляндия), щелочной резерв в об.% СО2 – диффузным методом (Кондрахин И.П. с соавт., 2004).

Содержание общих иммуноглобулинов определяли по величине светорассеивания после преципитации сульфатом цинка (Костына М.А., 1997), а IgG – методом простой радиальной иммунодиффузии в геле по G. Mancini (1965).

Содержание лигандных форм (Hb, HbO2, MetHb) в растворе гемоглобина определяли при 500, 569 и 577 нм, используя для расчета эмпирическую систему уравнений, предложенную Zwart A. с соавторами (Zwart A. et. al., 1981).

Содержание белка (г/л) определяли биуретовым методом (Досон Р., 1991); активность глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (Г6ФДГ) (мкМ НАДФ/мин*г Hb) по убыли НАДФН (Асатиани В.С., 1965).

Для оценки интенсивности процессов свободнорадикального окисления липидов и белков, состояния системы антиоксидантной защиты и функционирования системы L-аргинин-NO? в крови и сыворотке (плазме) крови животных определяли: содержание диеновых конъюгатов (ДК) (D232 /мг липидов) и кетодиенов (КД) (D278 /мг липидов) (Бузлама В.С. с соавт., 1997); содержание малонового диальдегида (МДА) (мкМ/л) (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977); содержание оснований Шиффа (ОШ) (отн. ед./мл сыв.) (Bidlack W.R., Tappel A.L., 1973); степень окислительной модификации белков (нМ/мг белка) (Reznick A.Z., 1994; Дубинина Е.Е., 1995); содержание молекул средней массы (ед.опт.пл.) (Гребнева О.Л. с соавт., 2006); потенциальную преимущественную генерацию супероксиданиона (нМоль О2 ( /г(сек) (Близнецова Г.Н. с соавт., 2004); содержание НЭЖК (мкМ/л) (Прохоров М.Ю. с соавт., 1977); сорбционную способность эритроцитов (%) (Тогайбаев А.А. с соавт., 1988); содержание восстановленного глутатиона (мМ/л) (Sedlak J., Lindsay R.H., 1968); активность каталазы (мкМ Н2О2/л(мин) (Королюк М.А., 1988); активность глутатионпероксидазы (мМ восстановленного глутатиона/л(мин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность глутатионредуктазы (мкМ окисленного глутатиона /л*мин) (Кругликова Г.О., Штутман И.М., 1976); активность супероксиддисмутазы (СОД) (усл.ед./мг Hb) (Сирота т.в., 1999); сумму стабильных метаболитов оксида азота (мкМ/л) (Близнецова Г.Н. с соавт, 2002); содержание S-нитрозотиолов (нМ/л) (Kubes P. et al., 1999; Moore K.P. et al., 2002).

Каждую пробу исследовали в 3-х аналитических повторностях. Обработку экспериментальных данных проводили методами математической статистики, принятыми в биологии и медицине. Достоверность различий оценивали методом парных сравнений, используя t-критерий Стъюдента. Статистически достоверными считали различия при уровне значимости р<0,05 (Лакин Г.Ф., 1990).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Видовые и возрастные особенности функционирования NO(- L-аргинин стресс-лимитирующей системы

Установлено, что для телят в первые часы жизни характерен очень высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови (рис. 1А). Через сутки после рождения уровень стабильных метаболитов оксида азота (NOх) снижается на 33,4%, а через 2-3 дня их концентрация уменьшается более чем в 2 раза по сравнению с содержанием их в сыворотке крови через 30-60 минут после рождения (до получения первой порции молозива). Начиная с 10-суточного возраста, суммарная концентрация NOх продолжает снижаться и к месячному возрасту достигает величин, близких к уровню NOх у взрослых животных, составляющему у коров в зависимости от срока до или после отела от 40 до 150 мкМ/л.

Для поросят сразу после рождения (до приёма молозива) также характерен высокий уровень стабильных метаболитов оксида азота, отражающий степень его образования в организме новорожденного (рис. 1Б). На 2-е сутки после рождения содержание в плазме крови NOх уменьшается более чем в 3 раза, а в 3-дневном возрасте концентрация NOх практически снижается до уровня, зафиксированного в возрасте 2-3 недель.

Уровень стабильных метаболитов оксида азота у ягнят до первой выпойки молозива так же превышал таковой у взрослых животных более чем в 10 раз (рис. 1В). Далее интенсивность образование оксида азота статистически достоверно снижалась за 1 сутки на 37,9%, в течение вторых суток – на 32,5%, и третьих – на 54,4%. Как видно из представленных данных динамика изменения изучаемого показателя у ягнят в целом была идентична таковой у других видов животных, с той лишь разницей, что содержание оксида азота в крови ягнят менялось более резко и достигало уже к 15-м суткам жизни значений, характерных для взрослых овцематок, составляющих 19-25 мкМ/л.

Рис. 1. Содержание стабильных метаболитов оксида азота

в плазме крови: А-телят, Б-поросят, В-ягнят, Г-детей (мкМ/л)

При определении суммы стабильных метаболитов в плазме пуповинной крови у новорожденных детей (n=14) установлено, что её величина колеблется в пределах от 25,6 до 45,0 мкМ/л и составляет в среднем 34,3(8,52 мкМ/л (рис. 1Г). Полученные данные свидетельствуют об отсутствии статистически достоверных различий между показателями, определенными у детей на 1, 5 и 30 сутки жизни.

Таким образом, установлено, что для новороженных телят, поросят и ягнят в первые сутки жизни характерно высокое содержание стабильных метаболитов оксида азота (NO2?+NO3?), которое существенно снижается к месячному возрасту.

3.2. Система оксида азота в период ранней постнатальной адаптации

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что экзогенное поступление больших количеств нитратов и нитритов телятам с молозивом и молоком коров может быть исключено, поскольку у коров их содержание изменялось в пределах 37,8–145,0 мкМ/л в зависимости от периода исследования.

Высокая концентрация NOх в сыворотке крови телят не является следствием недостаточной элиминации нитратов и нитритов из плазмы у новорожденных, чем у животных более старшего возраста, так как с возрастом снижается не только уровень стабильных метаболитов оксида азота в крови, но и выделение их с мочой (рис. 2).

Можно было бы объяснить установленный феномен тем, что высокая концентрация NOх у новорожденных телят, по сравнению с животными более старшего возраста, является следствием поступления в организм высоких концентраций оксида азота вместе с вдыхаемым воздухом, но при этом, как известно, значительно возрастает содержание метгемоглобина в крови (Salguero K.L., Cummings J.J., 2002). Исследования содержания в крови различных лигандных форм гемоглобина показало, что уровень метгемоглобина в крови у телят сразу после рождения составляет 1,5% от общей концентрации гемоглобина и снижается к месячному возрасту до 0,9 %.


загрузка...